Phylogenetic Analysis of the Baltic Skeletonema marinoi

Abstract

This thesis project was carried out in the Marine Research Centre of Finnish Environment Institute (SYKE) in the Modelling and Innovations Unit where researchers PhD Anke Kremp and PhD student Conny Sjöqvist are investigating phytoplankton ecology, biodiver-sity and population genetics, and one of the organisms under study is Skeletonema marinoi. The aim of this graduate study was to investigate the possible differentiation of the S. marinoi strains isolated in the Baltic Sea by phylogenetic analysis.

S. marinoi is a diatom species with worldwide distribution. As a photosynthezing organism it has a significant role in the carbon dioxide assimilation. Moreover, the typical diatom cell wall called frustule makes S. marinoi an important organism for the silica cycle on Earth. S. marinoi is highly abundant also in the Baltic Sea especially during the spring bloom. The Baltic Sea is an interesting brackish water basin with steep salinity gradient. Due to these facts S. marinoi is fundamentally studied in many aspects.

By phylogenetic analysis it is possible to gain huge amounts of information to understand the relationships between organism and even within species, moreover to investigate the evolutionary hypothesis. In this graduate study non-coding ITS region of rDNA was ana-lyzed to observe the possible variation within S. marinoi strains. The isolated strains were maintained in the laboratory and DNA was extracted. The ITS region was copied by PCR reaction and sequenced. The sequences were combined with sequences from the Gen-Bank to construct multiple alignments by ClustalW method in the MEGA program. Finally, phylogenetic trees were constructed based on the multiple alignments in the MEGA by Neighbor-Joining method. The trees were rooted by Thalassiosira rotula as an outgroup. In the end the reliability of the trees was estimated by Bootstrap analysis.

Two phylogenetic trees are represented in this graduate study. The first tree is relatively reliable according the Bootstrap values, and supports the hypothesis that differentiation has occurred within the S. marinoi strains in the Baltic Sea. The northern and southern strains have separated into their own clades which indicates that the salinity gradient in the Baltic Sea has caused adaption. The second tree is partly contradictory and cannot be explained well in this thesis project.

Opinnäytetyö toteutettiin Suomen ympäristökeskuksen Merikeskuksessa Innovaatiot ja mallit yksikössä, jossa erikoistutkija Anke Kremp ja tutkija Conny Sjöqvist tutkivat kasvi-planktonien ekologiaa, monimuotoisuutta sekä populaatiogenetiikkaa. Piilevä Skeletonema marinoi on yksi heidän tutkimistaan organismeista, ja tässä opinnäytetyössä oli tavoitteena fylogeneettisen analyysin avulla tutkia Itämerellä eristettyjen S. marinoi -kantojen erilais-tumista. Itämeri on murtovesiallas, jossa on voimakas suolagradientti, minkä seurauksena se on mielenkiintoinen tutkimuskohde. S. marinoi on maailmanlaajuisesti levinnyt piilevä, joka kukkii keväisin voimakkaasti myös Itämerellä. Yhteyttävänä organismina sillä on mer-kittävä rooli hiilensidonnassa. Lisäksi piileville tyypillinen piidioksidisoluseinärakenne tekee S. marinoista keskeisen organismin myös piinkierrossa.

Fylogeneettisen analyysin avulla on mahdollista saada paljon tietoa sekä lajien välisistä että sisäisistä suhteista. Analyysin avulla pystytään tutkimaan lajien evolutiivista historiaa. Tässä opinnäytetyössä analysoitiin ribosomaalisen DNA-alueen ITS-jaksoa, joka ei koodaa mitään geenejä eikä rRNA:ta, mutta on osoittautunut hyväksi fylogeneettiseksi markkeriksi lajinsisäisessä tutkimuksessa.

Työssä eristettiin DNA:ta laboratoriokasvatuksessa olleista S. marinoi -kannoista. DNA-näytteistä kopioitiin PCR-reaktiolla ITS-jaksoja, jotka lähetettiin sekvensoitaviksi. Sekvenssit linjattiin yhdessä GenBankista kerättyjen sekvenssien kanssa MEGA-ohjelmassa ClustalW-metodilla. Sekvenssirinnastuksista rakennettiin fylogeneettisiä puita MEGA-ohjelmassa Neighbor-Joining -metodilla. Puut juurrutettiin piilevä Thalassiosira rotulan avulla, ja puiden luotettavuus arvioitiin Bootstrap-analyysillä.

Tässä työssä esitellään kaksi fylogeneettistä puuta, joista ensimmäinen on suhteellisen luotettava Bootstrap-arvojen perusteella. Puussa Itämeren kannat ovat erottuneet Kanadan kannoista sekä Itämeren pohjoiset ja eteläiset kannat ovat eriytyneet omiin haaroihinsa. Havaittu järjestäytyminen tukee esitettyä hypoteesiä suolagradientin vaikutuksesta S. marinoin erilaistumiseen Itämerellä. Toinen puu ei ole kovin luotettava, eikä kantojen osin ristiriitaista järjestäytymistä pystytä selittämään tämän opinnäytetyön puitteissa.