Lactobacillus amylovorus -kantojen pintakerrosproteiinien kloonaus ja ilmentäminen

Abstract

Tämä opinnäytetyö toteutettiin Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan eläinlääketieteellisten biotieteiden osastolla, mikrobiologian ja epidemiologian oppiaineessa.

Pintakerrosproteiinit ovat molekyylipainoltaan 40 - 200 kDa:n painoisia proteiineja, jotka muodostavat monien bakteerien ja arkkien soluseinän uloimman kerroksen. Ne järjestäytyvät solun pinnalle huokoisiksi hilarakenteiksi. Pintakerrosproteiinien on todettu muun muassa suojaavan solua, toimivan kiinnityskohtana entsyymeille ja auttavan bakteeria kiinnittymään kudosten pinnoille.

Tämän työn tavoitteena oli kloonata kolmen eri Lactobacillus amylovorus -kannan (GRL1114, GRL1116 ja GRL1117) pinnalleen ilmentämien pintakerrosproteiinien koodaavat geenit ja puhdistaa rekombinanttipintakerrosproteiineja tulevaisuudessa tehtäviä jatkotutkimuksia varten.

L. amylovorus -kantojen kromosomaalisesta DNA:sta monistettiin PCR:llä pintakerrosproteiineja koodaava slp-geeni. GRL1114- ja GRL1116-kannoista monistettiin molemmista yksi slp-geeni ja GRL1117-kannasta kaksi eri slp-geeniä. Geenit ligoitiin pET-28b(+) -vektoriin ja transformoitiin Escherichia coli XL1 Blue -kantaan.

Rekombinanttipintakerrosproteiinit tuotettiin E. coli ekspressiosoluissa IPTG-induktion avulla. Proteiinit puhdistettiin affiniteettikromatografian avulla. Kaikkien pintakerrosproteiinigeenien kloonaus ja ilmentäminen onnistui. Tuotettujen pintakerrosproteiinien koot vaihtelivat 45 ja 66 kDa:n välillä ja niiden saannot olivat 1,76 - 3,76 mg.

This study was carried out at the University of Helsinki in the Faculty of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Biosciences, in the subject of Veterinary Microbiology and Epidemiology.

Surface layer proteins have a molecular weight of 40 to 200 kDa and they make up the outermost layer of the cell envelope of many bacteria and archaea. They form a highly porous lattice structure. The S-layer proteins have been found to, among other things, protect the cell, act as adhesion sites for exoenzymes and help the bacteria to adhere to different host tissues.

The aim of this study was to clone the S-layer protein coding genes from three Lactobacillus amylovorus strains (GRL 1114, GRL1116 and GRL1117) and purify the recombinant S-layer protein for follow-up studies.

The S-layer protein coding slp gene was amplified from chromosomal DNA using PCR. One slp gene was amplified from GRL1114 and GRL1116 strains and two slp genes from GRL1117 strain. The genes were ligated into the pET-28b(+) vector and transformed into Escherichia coli XL1 Blue strain.

The recombinant S-layer proteins were produced in E. coli expression cells using IPTG-induction. The protein purification was carried out using affinity chromatography. The cloning and expression of every slp-gene was successful. Surface layer protein product sizes ranged from 45 to 66 kDa and the yields were between 1.76 and 3.76 mg.