Angiotensiinikonvertaasientsyymi 1 (ACE1) ohutsuolessa : Fluorometrinen menetelmä aktiivisuuden määrittämiseksi

Abstract

Tämä opinnäytetyö toteutettiin Helsingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan biolääke-tieteen laitoksessa, farmakologian osastossa.

Reniini-angiotensiini -järjestelmä (RAS) säätelee verenpainetta ja elimistön fysiologista tasapainoa monissa eri kudoksissa. Järjestelmän aktivoituminen reniinin, angiotensino-geenin sekä angiotensiinikonvertaasientsyymin 1 (ACE1) kautta verenkierron välityksellä kohdekudoksiin on joutunut viime vuosikymmenten aikana uuteen valoon.

Järjestelmän komponentteja on löytynyt muun muassa ruoansulatuskanavasta, munuaisista, maksasta ja sydämestä. Samalla sen aktivoituminen on osoittautunut oletettua monimutkaisemmaksi. Järjestelmän säätely kudoksessa riippumattomasti verenkierron kautta tapahtuvasta komponenttien muodostumisesta avaa kysymyksiä sen fysiologisesta merkityksestä ja osallisuudesta sairauksien synnyssä.

Ruoansulatuskanavan RAS on vähän tutkittu paikallinen RAS. Niinpä sen osuus ohutsuolen häiriötiloissa, esimerkiksi ravintoaineiden imeytymistä ja motiliteettia koskevissa, ei ole selvä. Tässä opinnäytetyössä pyritään vahvistamaan aiempien tutkimusten havaintoja ja toisaalta valmistautumaan kliinisten näytteiden ACE1-aktiivisuuden mittaamiseen. Jos ACE1 on kliininen markkeri ohutsuolen häiriötiloissa, tarvitaan luotettava menetelmä sen aktiivisuuden mittaamiseksi.

Opinnäytetyössä käynnistettiin fluoresenssispektrofotometrinen menetelmä ACE1:n aktiivisuuden mittaamiseksi ohutsuolihomogenaateissa. Lisäksi RAS:n keskeisiä komponentteja tutkitaan immunofluoresenssivärjäyksellä ja Western blot -tekniikalla.

Tulokset osoittivat rotan ohutsuolessa olevan ACE1-aktiivisuutta. Aktiivisuus painottui ohutsuolen alkupäähän, duodenumiin ja jejunumiin, joissa aktiivisuus oli merkittävästi korkeampi kuin loppupäässä, ileumissa. Lisäksi havaittiin, että aktiivisuutta oli epiteelin ja lihaskerroksen kesken yksinomaan epiteelissä.

This thesis was carried out at the University of Helsinki in the Faculty of Medicine, Department of Biomedicine, in the section of Pharmacology.

The renin-angiotensin system (RAS) is one of the key regulators of blood pressure. In the classical form of the system renin and angiotensinogen activate the system in the circulation and angiotensin II (Ang II), which is produced by angiotensin-converting enzyme 1 (ACE1), mediates the vasoconstriction effects in the target tissues.

This classical view has turned out to be far more complex, as the components of the system have been identified throughout the human body including e. g. gastrointestinal tract, kidney, liver and heart. This has raised questions about the role of the system in local tissue homeostasis, diseases and the local regulation independent from circulative activation.

The function of the RAS in the small intestine and its possible role it have in the dysfunctions and diseases of the gastrointestinal tract is not very well known. All this is used as a background information to confirm the previous findings, which have shown the system’s components in the small intestine. In addition to this a measurement of clinical samples are prepared also. If RAS has a role in disorders concerning for example absorption and motility, the ACE1 activity can be an important clinical marker.

In this thesis a fluorescence spectrophotometrical method to measure ACE1 activity in intestinal homogenates is constructed. At the same time immunofluorescence staining and Western blot is used to identify the components of the RAS.

Results showed that the ACE1 activity in the rat small intestine is highest in the proximal part, in duodenum and jejunum. In the distal region, in ileum, the activity is much lower. When the activity was conducted in the epithelium and smooth muscle layer, the activity in the muscle layer was negligible.