Hemokromatoosi-geenimutaation kloonaaminen PCR-menetelmällä

Abstract

Hemokromatoosi on sairaus, jossa raudan imeytymisen säätely häiriintyy. Se aiheutuu yleisimmin HFE-geenissä tapahtuvista C282Y- ja H63D-mutaatioista. Taudissa rautaa kertyy elimistöön ylimäärin, koska sitä imeytyy jopa 3–4 kertaa enemmän kuin terveellä ihmisellä. Kun rautaa on elimistössä liikaa, se voi aiheuttaa kudosvaurioita ja hoitamattomana vahingoittaa tärkeitä elimiä, kuten maksaa, haimaa ja sydäntä.

Oulun seudun ammattikorkeakoulun bioanalytiikan koulutusohjelma sisältää Molekyylibiologian, geenitekniikan ja perinnöllisyyden harjoituskurssin, jossa tehdään hemokromatoosi-geenimutaation määrittäminen. Tässä harjoitustyössä käytetään positiivisena kontrollina genomista DNA:ta, jossa on hemokromatoosin aiheuttava geenimutaatio. Opinnäytetyömme tavoitteena oli kloonata hemokromatoosin HD-geenimutaatio plasmidivektoriin DNA:n monistamista varten, ja näin tuottaa lisää genomista DNA:ta harjoituskurssille. Aihe tuli Oulun seudun ammattikorkeakoululta.

Opinnäytetyössä käytettiin erilaisia geenitekniikan menetelmiä, kuten PCR, agaroosigeelielektroforeesi, ligaatio, transformaatio, DNA:n eristys ja DNA:n sekvensointi. Kaikki käytännön työt tehtiin Oulun seudun ammattikorkeakoulun tiloissa.

Hemokromatoosigeenin H63D-mutaatio onnistuttiin kloonaamaan ja monista-maan. Neljästä jatkoon valitusta plasmidi-DNA-näytteestä kahdessa oli hemo-kromatoosi-geenimutaation sisältävää DNA:ta. Jatkossa näitä kahta näytettä voidaan käyttää harjoitustyössä positiivisena kontrollina.

Hemochromatosis is a disease in which iron metabolism is disturbed. It is most commonly caused by two mutations in the HFE-gene, namely C282Y and H63D. In hemochromatosis the body accumulates too much iron. The amount absorbed into the body can be 3–4 times more than normally. When there is too much iron in the body, it can damage tissues and without treatment, it harms vital organs like liver, pancreas and heart.

This thesis was made for Oulu University of Applied Sciences. The aim of the thesis was to clone genomic DNA, which contains hemochromatosis genetic mutation into a plasmid and then multiply it. University can use this DNA in practical training of Molecular Biology, Gene Technology and Genetics course. In the practical work students determine hemochromatosis mutation and the DNA containing the mutation is used as a positive control.

In this thesis we used gene technology methods like PCR, agarose gel electro-phoresis, ligation, transformation, extracting of DNA and DNA sequencing. All the practical work was done in the premises of Oulu University of Applied Sci-ences. Also starting material, reagents and other components were given by the university.

Through many phases, genomic DNA was successfully cloned and multiplied. From the four of the chosen plasmid-DNA-samples, two contained the hemo-chromatosis mutation. In the future the university can use these DNA samples as a positive control.