Vasta-ainegeenikirjastojen luominen ja seulonta kahdelle siitepölyallergeenille

Abstract

Valtion teknillisessa tutkimuskeskuksessa (VTT) suoritetun opinnäytetyön tarkoituksena oli kloonata vasta-ainegeenikirjastot koivun (Bet v 1) ja timotein (Phl p 1) allergeeneille. Vasta-ainegeenit oli eristetty aiemmin immunisoitujen hiirien cDNA-fragmenteista.

Kevyen ja raskaan ketjun vasta-ainegeenifragmentit kloonattiin faaginäyttövektoriin ja niistä tehtiin faaginäyttökirjastoja. Näistä kirjastoista eristettiin kohdeallergeenejä tunnistavia vasta-aineita faaginäyttötekniikan avulla. Eristettyjä klooneja karakterisoitiin immunologisin menetelmin ELISAlla ja Western blottauksella.

Molemmista faaginäyttökirjastoista onnistuttiin eristämään positiivisia klooneja. Koivun faaginäyttökirjaston analysointi lopetettiin seulontojen jälkeen. Timotein faaginäyttökirjastoilla infektoitiin Escherichia coli XL-1 Blue soluja, jossa niitä kasvatettiin ja tehtiin Fab-pIII fuusioproteiinin induktio.

Jatkotestejä varten valittiin 12 kloonia toiselta seulontakierrokselta ja 12 kloonia kolmannelta seulontakierrokselta. Fuusioproteiinien sitoutumista antigeeniin testattiin ELISAlla. Tämän perusteella valittiin 12 positiivista kloonia jatkoon, jossa kloonien affiniteettiä ja spesifisyyttä antigeeniin testattiin ELISAlla ja Western blottauksella. Näiden tulosten perusteella saatiin viisi kloonia, joita voidaan käyttää vasta-aineiden tuotossa.

Valitut kloonit voidaan liittää tuottovektoriin, jossa niitä voidaan tuottaa liukoisessa muodossa ja transformoida tuottosoluihin. Tuotettuja allergeeniä tunnistavia vasta-aineita voidaan puhdistaa kromatografisin menetelmin jatkokäyttöä varten. Vasta-aineita tullaan hyödyntämään allergeenien osoitus- ja pitoisuusmäärityksissä.

This thesis was carried out at the VTT Technical Research Centre of Finland. The purpose of the study was to create antibody gene libraries for allergens in birch (Betula pendula, Bet v 1) and timothy grass (Phleum pretense, Phl p 1). Antibody gene fragments were isolated from cDNA fragments of mice that were earlier immunized with the allergens.

Light and heavy chain gene fragments were cloned in phagemid vector and turned into phage display libraries. Antigen binding antibodies were enriched with a phage display technique (panning). Isolated clones were tested with ELISA and Western blotting.

Positive clones were found in libraries for both allergens. Analyzing the birch antibody library was quitted after panning due to lack of time. The phage display library of Phl p 1 was used to infect Escherichia coli XL1-Blue cells in which the expression of fusion protein Fab-pIII was induced.

12 clones from the second panning round and 12 clones from the third panning round were chosen for further testing. The fusion protein binding to antigen was analyzed with ELISA. 12 positive antibody producing clones were chosen and their affinity and specificity was tested with ELISA and Western blotting. Five clones were chosen according to these results. The clones chosen can be used in producing antibodies.

The clones chosen can be cloned in an expression vector and transformed in E.coli cells for production of soluble proteins. Produced proteins or their modified versions can be purified with chromatographic methods. These allergen specific recombinant antibodies will be applied in detection and quantification assays.