Vasta-ainegeenikirjastojen luominen ja seulonta kahdelle siitepölyallergeenille
Heiniluoto, Heidi (2013)
Heiniluoto, Heidi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013120319743
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013120319743
Tiivistelmä
Valtion teknillisessa tutkimuskeskuksessa (VTT) suoritetun opinnäytetyön tarkoituksena oli kloonata vasta-ainegeenikirjastot koivun (Bet v 1) ja timotein (Phl p 1) allergeeneille. Vasta-ainegeenit oli eristetty aiemmin immunisoitujen hiirien cDNA-fragmenteista.
Kevyen ja raskaan ketjun vasta-ainegeenifragmentit kloonattiin faaginäyttövektoriin ja niistä tehtiin faaginäyttökirjastoja. Näistä kirjastoista eristettiin kohdeallergeenejä tunnistavia vasta-aineita faaginäyttötekniikan avulla. Eristettyjä klooneja karakterisoitiin immunologisin menetelmin ELISAlla ja Western blottauksella.
Molemmista faaginäyttökirjastoista onnistuttiin eristämään positiivisia klooneja. Koivun faaginäyttökirjaston analysointi lopetettiin seulontojen jälkeen. Timotein faaginäyttökirjastoilla infektoitiin Escherichia coli XL-1 Blue soluja, jossa niitä kasvatettiin ja tehtiin Fab-pIII fuusioproteiinin induktio.
Jatkotestejä varten valittiin 12 kloonia toiselta seulontakierrokselta ja 12 kloonia kolmannelta seulontakierrokselta. Fuusioproteiinien sitoutumista antigeeniin testattiin ELISAlla. Tämän perusteella valittiin 12 positiivista kloonia jatkoon, jossa kloonien affiniteettiä ja spesifisyyttä antigeeniin testattiin ELISAlla ja Western blottauksella. Näiden tulosten perusteella saatiin viisi kloonia, joita voidaan käyttää vasta-aineiden tuotossa.
Valitut kloonit voidaan liittää tuottovektoriin, jossa niitä voidaan tuottaa liukoisessa muodossa ja transformoida tuottosoluihin. Tuotettuja allergeeniä tunnistavia vasta-aineita voidaan puhdistaa kromatografisin menetelmin jatkokäyttöä varten. Vasta-aineita tullaan hyödyntämään allergeenien osoitus- ja pitoisuusmäärityksissä.
Kevyen ja raskaan ketjun vasta-ainegeenifragmentit kloonattiin faaginäyttövektoriin ja niistä tehtiin faaginäyttökirjastoja. Näistä kirjastoista eristettiin kohdeallergeenejä tunnistavia vasta-aineita faaginäyttötekniikan avulla. Eristettyjä klooneja karakterisoitiin immunologisin menetelmin ELISAlla ja Western blottauksella.
Molemmista faaginäyttökirjastoista onnistuttiin eristämään positiivisia klooneja. Koivun faaginäyttökirjaston analysointi lopetettiin seulontojen jälkeen. Timotein faaginäyttökirjastoilla infektoitiin Escherichia coli XL-1 Blue soluja, jossa niitä kasvatettiin ja tehtiin Fab-pIII fuusioproteiinin induktio.
Jatkotestejä varten valittiin 12 kloonia toiselta seulontakierrokselta ja 12 kloonia kolmannelta seulontakierrokselta. Fuusioproteiinien sitoutumista antigeeniin testattiin ELISAlla. Tämän perusteella valittiin 12 positiivista kloonia jatkoon, jossa kloonien affiniteettiä ja spesifisyyttä antigeeniin testattiin ELISAlla ja Western blottauksella. Näiden tulosten perusteella saatiin viisi kloonia, joita voidaan käyttää vasta-aineiden tuotossa.
Valitut kloonit voidaan liittää tuottovektoriin, jossa niitä voidaan tuottaa liukoisessa muodossa ja transformoida tuottosoluihin. Tuotettuja allergeeniä tunnistavia vasta-aineita voidaan puhdistaa kromatografisin menetelmin jatkokäyttöä varten. Vasta-aineita tullaan hyödyntämään allergeenien osoitus- ja pitoisuusmäärityksissä.