Ihmisen fibronektiinin type III toistojaksojen kloonaaminen rekombinantin fuusioproteiinin tuottamiseksi
Ukonaho, Teemu (2013)
Oulun seudun ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013120319817
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013120319817
Tiivistelmä
Opinnäytetyö liittyy Oulun yliopiston, biolääketieteen laitoksen, fysiologian yksikössä käynnissä olevaan tutkimusprojektiin, jossa selvitetään spesifisten vasta-aineiden kohdemolekyyleissä olevia sitoutumisrakenteita. Tieto auttaa suunnittelemaan vasta-aineiden käyttösovellutuksia. Opinnäytetyössä valmistetaan yhdistelmä-DNA-plasmideja, joiden avulla kohdemolekyylin alueelta voidaan tuottaa valikoituja toiminnallisia osia eli domeeneja yhdistelmä- eli fuusioproteiinina Escherichia coli -bakteerissa. Työn tavoitteena on valmistaa ja muokata solumateriaalista molekyylityökalu, joka sisältää tarvittavan geneettisen tiedon halutunlaisen valkuaisaineen tuottamiseksi bakteerissa.
Geenitekniikan menetelmiä soveltamalla soluista eristetään valkuaisaineen ohjekoodit sisältävä RNA-pooli, joka käännetään cDNA-muotoon. Tästä monistetaan spesifisillä alukkeilla PCR-menetelmällä halutut geenijaksot, jotka muokataan entsymaattisesti sopimaan yhteen kaupallisen proteiinintuottovektorin kanssa. Plasmidit siirretään kemiallisesti käsiteltyihin E.coli -bakteereihin. DNA-materiaalia tutkitaan entsyymikäsittelyllä, PCR-menetelmällä, agaroosigeelielektroforeesilla sekä sekvensointireaktiolla. Tuloksia verrataan teoreettisiin arvoihin, kuten molekyylien kokoon tai emäsjärjestykseen.
Työssä valmistettiin yhdistelmä-DNA plasmidit, joiden avulla voi tuottaa bakteerissa ihmisen fibronektiinin tyypin III toistojaksot 1 sekä 1–2 fuusioituna tioredoksiiniin. Yhdistelmä-DNA plasmidilla voidaan tuottaa kaksi seitsemästä tutkimuksen kohteena olevasta domeiinista. Jatkossa plasmideilla tuotetaan tuottokannassa T7 Express kyseisiä fuusioproteiineja, ja puhdistetaan ne IMAC-menetelmällä. Puhdistettuja fuusioproteiineja käytetään ELISA vasta-ainetestissä sekä suoraan sitoutumisen testaamiseen sekä kompetetiiviseen reaktioon cyto-ELISAssa, syrjäyttämään vasta-aineen sitoutuminen solun pintaan.
Geenitekniikan menetelmiä soveltamalla soluista eristetään valkuaisaineen ohjekoodit sisältävä RNA-pooli, joka käännetään cDNA-muotoon. Tästä monistetaan spesifisillä alukkeilla PCR-menetelmällä halutut geenijaksot, jotka muokataan entsymaattisesti sopimaan yhteen kaupallisen proteiinintuottovektorin kanssa. Plasmidit siirretään kemiallisesti käsiteltyihin E.coli -bakteereihin. DNA-materiaalia tutkitaan entsyymikäsittelyllä, PCR-menetelmällä, agaroosigeelielektroforeesilla sekä sekvensointireaktiolla. Tuloksia verrataan teoreettisiin arvoihin, kuten molekyylien kokoon tai emäsjärjestykseen.
Työssä valmistettiin yhdistelmä-DNA plasmidit, joiden avulla voi tuottaa bakteerissa ihmisen fibronektiinin tyypin III toistojaksot 1 sekä 1–2 fuusioituna tioredoksiiniin. Yhdistelmä-DNA plasmidilla voidaan tuottaa kaksi seitsemästä tutkimuksen kohteena olevasta domeiinista. Jatkossa plasmideilla tuotetaan tuottokannassa T7 Express kyseisiä fuusioproteiineja, ja puhdistetaan ne IMAC-menetelmällä. Puhdistettuja fuusioproteiineja käytetään ELISA vasta-ainetestissä sekä suoraan sitoutumisen testaamiseen sekä kompetetiiviseen reaktioon cyto-ELISAssa, syrjäyttämään vasta-aineen sitoutuminen solun pintaan.