Magneettihelmiin ja vasta-aineisiin perustuvan näytteenkäsittelyn kehittäminen miniatyrisoiduille analyysilaitteille

Abstract

Tässä opinnäytetyössä kehitettiin magneettihelmiin ja vasta-aineisiin perustuvaa näytteenkäsittelymenetelmää miniatyrisoiduille analyysilaitteille. Työssä keskityttiin tutkimaan lämpöön reagoivia nanokokoisia magneettipartikkeleita (TMLA) erilaisissa näytematriiseissa.

Anti-foolihappovasta-ainefragmentti (Fab) tuotettiin E. coli RV308 -bakteerissa pienimuotoisena kahden litran kasvatuksena. Tuotettu vasta-aine puhdistettiin metalliaffiniteettikromatografisesti ja konjugoitiin biotiinin kanssa. Mallimolekyyli foolihappo konjugoitiin alkalinen fosfataasi -entsyymin kanssa.

Systeemin pystytyksessä etsittiin alkaliselle fosfataasille inhibiittori, NaH2PO4, vertailtiin anti-foolihappo- sekä anti-mykofenolihappovasta-aineita keskenään sekä TMLA- magneettihelmien määrän vaikutusta menetelmän toistettavuuteen. Päädyttiin jatkamaan kokeita anti-foolihappovasta-aineella ja käyttämään näytteissä 25 µl magneettihelmiä.

Foolihappo-alkalinen fosfataasi -konjugaatin tarttumista vasta-ainekonjugoituihin TMLA-magneettihelmiin tutkittiin puskurista, kliinisistä matriiseista; seerumista, syljestä ja virtsasta sekä nestemäisistä elintarvikematriiseista. Tutkittiin myös pH:n ja proteiinien vaikutusta tarttumiseen, määritettiin sitoutumisen saantoa ja vertailtiin lämpöön reagoivia magneettihelmiä perinteisiin magneettihelmiin. Havaittiin, että tätä systeemiä voidaan käyttää foolihappo-AP:n määrittämiseen seerumista, virtsasta, kahvista ja teestä. Myös neutraloidut omenamehu ja punaviini soveltuivat matriiseiksi. Syljen viskositeetti esti foolihappo-AP:n määrittämistä ja siinä toistettavuus oli heikkoa. Myös maitoproteiini, kaseiini, häiritsi termoresponsiivisia magneettisia nanopartikkeleita tässä systeemissä.

TMLA-helmiä testattiin myös näytteenkäsittelymenetelmänä kapillaarielektroforeesia varten sekä piisirulla.

The aim of this study was to develop sample preparation methods based on magnetic beads and antibodies for miniature analysis equipment. The study concentrated on researching thermo-responsive magnetic nanoparticles (TMLA) in different sample matrixes. Also a recombinant antibody was produced in Escherichia coli and low molecular weight analytes were conjugated with protein.

Production of anti-folic acid antibody fragment (Fab) was performed in E. coli RV308 in small scale. The antibody was purified with metal affinity chromatography and conjugated with biotin. Analyte folic acid was conjugated with alkaline phosphatase enzyme.

The model system set-up included finding an inhibitor for alkaline phosphatase, NaH2PO4, comparing anti-mycophenolic acid antibody to anti-folic acid antibody and determining the influence of different amounts of TMLA magnetic beads on repeatability. Based on the test results, a decision was made to continue testing with anti-folic acid antibody and 25 µl of magnetic beads.

The recovery of folic acid alkaline phosphatase conjugate was studied with TMLA beads from buffer, clinical matrixes; serum, saliva and urine, and from liquid food related sample matrixes. Recovery studies were also carried out and TMLA beads compared to traditional magnetic beads. In addition, the effects of pH and high protein concentration were examined.

The tests showed that this system can be used to study folic acid AP from serum, urine, coffee and tea. Neutralized apple juice and red wine are suitable matrixes, as well. The viscosity of saliva led to a great deal of variability between parallels. The milk protein ca-seine also disturbed TMLA beads in this system.

TMLA-bead were also tested in silicon micro chip and as an off-line sample preparation method for capillary electrophoresis.