D3-vitamiinin määrittäminen maidosta LC-MS/MS-menetelmällä: menetelmän käyttöönotto ja validointi

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Elintarviketurvallisuusviraston (Evira) Kemian ja toksikologian tutkimusyksikössä, jonka laboratorio on FINAS-akkreditoitu standardin SFS-EN ISO/IEC 17025:2005 mukaan.

Opinnäytetyössä oli tavoitteena saada uusi menetelmä D3-vitamiinin määrittämiseen maidosta. Ennen kuin määritysmenetelmä voidaan hyväksyä käyttöön, on varmistettava sen toimivuus ja validoitava menetelmä.

Suomessa D-vitamiinia lisätään maitotaloustuotteisiin, koska vitamiinin saanti auringonvalon vaikutuksesta on vähäistä. Maitotaloustuotteisiin lisätään vitamiini D3-muodossa, joka on peräisin eläinkunnasta. Tämän takia määritysmenetelmä tarvitaan nimenomaan D3-muodon analysointiin.

Aikaisempi määritysmenetelmä D3-vitamiinin määrittämiseen on LC-UV-tekniikka, jossa on aikaa vievä näytteen esikäsittely. Kirjallisuudesta löytyi menetelmä, joka perustuu LC-MS/MS-tekniikkaan ja jossa näytteen esikäsittely on yksinkertaisempi.

Ennen menetelmän validointia sen toimivuus varmistettiin vertaamalla sitä jo monta vuotta käytössä olleeseen akkreditoituun menetelmään. Tämän jälkeen menetelmälle tehtiin validointi, jossa määritettiin matriisin vaikutus analyyttiin, selektiivisyys, spesifisyys, lineaarisuus, toistettavuus, uusittavuus, toteamis- ja määritysraja sekä menetelmän saanto. Saaduista tuloksista arvioitiin menetelmän laajennettu mittausepävarmuus.

Lisäksi tehtiin vielä pieni säilyvyyskoe, jossa todettiin, että derivoitu näyte säilyy huoneenlämmössä vähintään yhdeksän vuorokautta. Tämä helpottaa käytännön työskentelyä, kun näytteitä voidaan tehdä useampana päivänä peräkkäin ja analysoida useampi näyte yhtä aikaa.

Opinnäytetyön lopputuloksena saatiin uusi validoitu menetelmä D3-vitamiinin määrittämiseen maidosta. Menetelmä tullaan ottamaan käyttöön Evirassa.

The thesis was conducted at Finnish Food Safety Authority (Evira) at the laboratory of Chemistry and Toxicology Unit. The laboratory is an accredited according to SFS-EN ISO/IEC 17025:2005.

The purpose of this thesis was to test a new method for analyzing vitamin D3 in milk. Before the method can be accepted into the routine analysis, the capability of the method is confirmed. In addition, the method has to be validated.

Sunlight exposure is by far the most important source of vitamin D. As the sunlight is limited during winter time in Finland, vitamin D is added to dairy products. The form of vitamin D in dairy products is animal origin of vitamin D3. For that reason, in this thesis focused on vitamin D3.

At the moment, the method used in routine analysis for vitamin D3 is based on the LC-UV technique, where the sample preparation is timeconsuming. In the literature was found an LC-MS/MS method with simpler sample preparation.

The capability of the LC-MS/MS method was tested by comparing it with the accredited LC-UV method used in the laboratory. After that, the LC-MS/MS method was validated including the determination of matrix effect, selectivity, linearity, specificity, repeatability, reproducibility, the limit of detection, the limit of quantification and recovery. The uncertainty of measurement was evaluated with the results of the validation.

In addition, the stability of the derived sample was tested. The derived sample was stable for at least nine days in room temperature. Due to this stability, the samples can be stored and many sequences can be analyzed at the same LC-MS/MS run.

In conclusion, a new LC-MS/MS method was validated for the determination of vitamin D3 in milk. The method will be used in routine analysis in near future.