Listerian kvalitatiivisen määritysmenetelmän kehittäminen

Abstract

Listeriaa tavataan maaperässä, vedessä ja eläimissä lähes kaikissa eläinlajeissa. Sitä tavataan myös oireettomilla, terveillä ihmisillä suolistossa. Listeria monocytogenes on patogeeninen sekä ihmisille että eläimille. Se voi aiheuttaa keskenmenoja raskaana oleville naisille sekä keuhkokuumetta vanhuksille ja pikkulapsille. Listeria on lyhyt gram-positiivinen sauva, katalaasipositiivinen ja oksidaasinegatiivinen.

Opinnäytetyö tehtiin Saarioinen Oy:lle. Työn tavoitteena oli ottaa käyttöön listeriabakteerien uusi LPT-tutkimusmenetelmä, jonka avulla saataisiin tulokset nopeammin ja vähemmällä työajalla kuin aikaisemmin. Menetelmän kehittäminen koostui erillisistä parametreistä, joilla tarkasteltiin menetelmän oikeellisuutta, määritysrajaa, spesifisyyttä sekä herkkyyttä. Menetelmän ulkoinen pätevyys on osoitettu osallistumalla SLV:n järjestämiin vertailukokeisiin.

Listerian toteamisessa LPT-menetelmällä käytettiin yksivaiheista rikastusta. Näytteet tutkittiin MiniVidas-immunoanalysaattorilla, joka on ELISA-pohjainen menetelmä ja perustuu immunofluoresenssiin. Positiivisiksi todetuista näytteistä tehtiin siirrostus ALOA-maljalle. Tyypillisistä pesäkkeistä tehtiin puhdasviljelmät naudan veriagarille ja tyypilliset pesäkkeet varmennetaan API Listeria -testillä ja tarvittaessa gram-värjäyksellä

Opinnäytetyössä suoritettiin kevyempi osittainen validointi, jonka tarkoituksena oli osoittaa menetelmän toimivuus. Menetelmä on jo kansainvälisissä tutkimuksissa validoitu ja stan-dardoitu. Validoinnin perusteella testattua Listerian tutkimismenetelmää voidaan pitää pätevänä osoittamaan Listeria spp -bakteerit erilaisista elintarvike- ja ympäristönäytteistä.

Listeria can be found in soil, water, and in almost any species of animals. It can also be carried by healthy, symptomless humans in their intestines. Listeria monocytogenes is pathogenic for both humans and animals causing miscarriages as well as pneumonia in elderly people and little children. Listeria is a short Gram-positive rod-shaped bacterium, catalase-positive and oxidase-negative, and it hydrolyzes esculin.

The objective of the thesis was to introduce a new VIDAS method of researching Listeria spp bacteria, which would help to get the results faster and more efficiently than before. The validation consisted of separate parameters that examined authenticity, detection limit, specificity and sensitivity of the method. The external validity of the method has been au-thenticated by taking part in comparative tests arranged by SLV.

Single-stage enrichment was applied when using the LPT method for detecting listeria. A ready-to-use LPT liquid was used in the enrichment process. After incubation, the concen-trate was analyzed in a VIDAS run. The samples were examined using the MiniVidas im-muno analyzer, which is an ELISA-based method, and is based on immunofluorescence antibody detection.

For positive samples, an inoculation was performed on a solid and selective growth medi-um that includes an indicator system. Pure cultures were made of typical colonies on a cattle blood agar. Typical colonies were confirmed by using the API Listeria test, and Gram dyeing, when necessary.

A simpler, partial validation was performed to prove the operability of the method. The method has already been validated and standardized in international researches. According to the validation, the tested research method of listeria can be regarded as a valid way to identify Listeria spp bacteria in different kinds of grocery or environmental samples.