qPCR-laitteen käyttöönotto ja validointi salmonellan kvalitatiiviseen määritykseen rypsi- ja rapsipuristeista
Rahikka, Marianne (2022)
Rahikka, Marianne
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202202042122
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202202042122
Tiivistelmä
Enterobakteereihin kuuluva salmonella on globaalisti yksi yleisimmistä gastroenteritiitin aiheuttajista. Tuotantoeläimille syötettävissä rehuissa ei Suomen lain mukaan saa esiintyä salmonellaa, joten rehun tuottajan on tutkittava tuotteensa salmonellan varalta. Tämän opinnäytetyön toimeksiantaja, Avena Kantvik Oy, tuottaa puristusprosessissaan rypsi- ja rapsiöljyn lisäksi valkuaispitoista puristetta rehuteollisuuden raaka-aineeksi. Avenan laadunvarmistuslaboratorio analysoi salmonellaa tuotantoprosessin lopputuotteiden vuorokausinäytteistä, lastauksen aikana kerätyistä sekä prosessiympäristöstä kerätyistä puristenäytteistä. Määritykseen laboratorio käyttää ISO/IEC 17025 -standardin mukaista kvalitatiivista qPCR-menetelmää.
Työn tavoitteena oli käyttöönottaa ja validoida uusi QuantStudio™ 5 qPCR-laite salmonellan kvalitatiiviseen määritykseen rypsi-/rapsipuristeista. Erityisenä tavoitteena oli tutkia myös kolloidisen matriisin vaikutusta qPCR-reaktion onnistumiseen. Reaktion onnistumista seurattiin sisäisen positiivisen kontrollin (IPC) monistumisen avulla. Sakkaisen näytteen tiedettiin ajoittain inhiboivan IPC:n monistumista. Inhibitiota voi kuitenkin ehkäistä näytteen laimentamisella.
qPCR-laitteelle tehtiin asennustarkastus ja toiminnallinen tarkastus. Laitteen suorituskykyä testaavat validointinäytteet olivat prosessin vuorokausinäytteitä sekä lastausja ympäristönäytteitä. Esirikastettujen näytteiden soluhajotukseen ja qPCR-reaktioseoksen valmistukseen käytettiin SureTect™ Salmonella species PCR Assay -kittiä. Näytteet ajettiin QS5:llä, referenssimenetelmänä käytettiin PikoReal-laitetta. Ajotulokset (negatiiviset tai positiiviset) käsiteltiin RapidFinder Analysis -ohjelmalla.
qPCR-ajojen perusteella 1:5-laimennos osoittautui toimivaksi: IPC-signaali oli tasaisempi ja eksponentiaalinen vaihe oli selkeä. Tärkeintä oli kuitenkin laitteen kyky luotettavasti löytää salmonella näytteestä. Validoinnin aikana laite antoi 2 virhenegatiivista tulosta aidosti positiivisia näytteitä analysoitaessa, mikä vähentää laitteen herkkyyttä. PikoRealiin verrattaessa uuden laitteen herkkyydeksi saatiin 80 %, spesifisyydeksi 100 % ja suhteelliseksi tarkkuudeksi 91 %. Cohenin kappa Κ0 oli 0,81 (>0,80, erittäin yhtäpitävät menetelmät) ja χ2-testi tuotti arvon 0,5 (<3,84, todellisesti ja oletettujen positiivisten tulosten välillä ei tilastollisesti merkitsevää eroa).
Työn tavoitteena oli käyttöönottaa ja validoida uusi QuantStudio™ 5 qPCR-laite salmonellan kvalitatiiviseen määritykseen rypsi-/rapsipuristeista. Erityisenä tavoitteena oli tutkia myös kolloidisen matriisin vaikutusta qPCR-reaktion onnistumiseen. Reaktion onnistumista seurattiin sisäisen positiivisen kontrollin (IPC) monistumisen avulla. Sakkaisen näytteen tiedettiin ajoittain inhiboivan IPC:n monistumista. Inhibitiota voi kuitenkin ehkäistä näytteen laimentamisella.
qPCR-laitteelle tehtiin asennustarkastus ja toiminnallinen tarkastus. Laitteen suorituskykyä testaavat validointinäytteet olivat prosessin vuorokausinäytteitä sekä lastausja ympäristönäytteitä. Esirikastettujen näytteiden soluhajotukseen ja qPCR-reaktioseoksen valmistukseen käytettiin SureTect™ Salmonella species PCR Assay -kittiä. Näytteet ajettiin QS5:llä, referenssimenetelmänä käytettiin PikoReal-laitetta. Ajotulokset (negatiiviset tai positiiviset) käsiteltiin RapidFinder Analysis -ohjelmalla.
qPCR-ajojen perusteella 1:5-laimennos osoittautui toimivaksi: IPC-signaali oli tasaisempi ja eksponentiaalinen vaihe oli selkeä. Tärkeintä oli kuitenkin laitteen kyky luotettavasti löytää salmonella näytteestä. Validoinnin aikana laite antoi 2 virhenegatiivista tulosta aidosti positiivisia näytteitä analysoitaessa, mikä vähentää laitteen herkkyyttä. PikoRealiin verrattaessa uuden laitteen herkkyydeksi saatiin 80 %, spesifisyydeksi 100 % ja suhteelliseksi tarkkuudeksi 91 %. Cohenin kappa Κ0 oli 0,81 (>0,80, erittäin yhtäpitävät menetelmät) ja χ2-testi tuotti arvon 0,5 (<3,84, todellisesti ja oletettujen positiivisten tulosten välillä ei tilastollisesti merkitsevää eroa).