UPLC-MS/MS-menetelmän kehitys solunsisäisten metaboliayhdisteiden analyysiin
Tanhola, Esa (2022)
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202202102347
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202202102347
Tiivistelmä
Solunsisäinen metabolia koostuu useiden peräkkäisten entsyymikatalysoitujen kemiallisten reaktioiden ketjuista, joita kutsutaan metaboliareiteiksi. Metaboliareittien avulla solut tuottavat elintoimintoihin tarvitsemansa energian ja rakennusaineet. Reaktioketjuissa syntyviä yhdisteitä kutsutaan metaboliiteiksi. Analysoimalla tietyn ajanjakson aikana syntyneiden metaboliittien pitoisuuksia pystytään määrittämään aineiden muuntumisnopeus metaboliareiteissä, mikä kertoo solunsisäisestä entsyymiaktiivisuudesta. Saadun datan avulla pystytään optimoimaan kasvatusmenetelmiä ja selvittämään metaboliareittien aktiivisuutta eri kasvuolosuhteissa. Tietokoneohjelmilla pystytään luomaan metabolisia malleja ja simulaatioita, joilla solun sisäisiä toimintoja pystytään tarkastelemaan laajemmassa mittakaavassa.
Tämän työn tilaaja oli VTT Oy ja työ toteutettiin bioanalytiikkaosaston analytiikkalaboratoriossa. Työ tarkoitus oli kehittää kvantitatiivinen UPLC-MS/MS-menetelmä poolisten solunsisäisten metaboliittien analyysiin. Tavoitteena oli tutkia mahdollisuutta saada useita erilaisia yhdisteryhmiä analysoitua samanaikaisesti yhdellä menetelmällä, mikä vähentäisi analyysiin tarvittavaa työmäärää ja aikaa.
Testattavaksi valittiin 29 keskeisiin metaboliareitteihin kuuluvaa yhdistettä. Nestekromatografia optimoitiin testaamalla kolmea kolonnivaihtoehtoa, eri puskuriliuoksia ja niiden konsentraatiota, virtausnopeutta, lämpötilaa ja optimaalista gradienttia. Massaspektrometrin parametrit optimoitiin luomalla kullekin yhdisteelle MRM-menetelmä, korkean spesifisyyden takaamiseksi.
Menetelmän toimivuutta testattiin hiivasolunäytteiden avulla. Näytteistä saatiin analysoitua 18 yhdistettä, kaikista 29:stä. Ongelmia aiheutti yhdisteiden suuri määrä, isobaariset yhdisteet, metaboliittien epästabiilisuus liuoksissa sekä heikko vaste massa-analysaattorissa. Työn tuloksena todettiin, ettei eri yhdisteryhmien optimointi yhdelle menetelmälle ei ole kannattavaa, mikäli halutaan korkealaatuisia kvantitatiivisia tuloksia. Kaikkien haluttujen yhdisteiden saaminen menetelmään vaatii menetelmän jatkokehitystä, ja menetelmä tulee myös validoida sen luotettavuuden takaamiseksi.
Tämän työn tilaaja oli VTT Oy ja työ toteutettiin bioanalytiikkaosaston analytiikkalaboratoriossa. Työ tarkoitus oli kehittää kvantitatiivinen UPLC-MS/MS-menetelmä poolisten solunsisäisten metaboliittien analyysiin. Tavoitteena oli tutkia mahdollisuutta saada useita erilaisia yhdisteryhmiä analysoitua samanaikaisesti yhdellä menetelmällä, mikä vähentäisi analyysiin tarvittavaa työmäärää ja aikaa.
Testattavaksi valittiin 29 keskeisiin metaboliareitteihin kuuluvaa yhdistettä. Nestekromatografia optimoitiin testaamalla kolmea kolonnivaihtoehtoa, eri puskuriliuoksia ja niiden konsentraatiota, virtausnopeutta, lämpötilaa ja optimaalista gradienttia. Massaspektrometrin parametrit optimoitiin luomalla kullekin yhdisteelle MRM-menetelmä, korkean spesifisyyden takaamiseksi.
Menetelmän toimivuutta testattiin hiivasolunäytteiden avulla. Näytteistä saatiin analysoitua 18 yhdistettä, kaikista 29:stä. Ongelmia aiheutti yhdisteiden suuri määrä, isobaariset yhdisteet, metaboliittien epästabiilisuus liuoksissa sekä heikko vaste massa-analysaattorissa. Työn tuloksena todettiin, ettei eri yhdisteryhmien optimointi yhdelle menetelmälle ei ole kannattavaa, mikäli halutaan korkealaatuisia kvantitatiivisia tuloksia. Kaikkien haluttujen yhdisteiden saaminen menetelmään vaatii menetelmän jatkokehitystä, ja menetelmä tulee myös validoida sen luotettavuuden takaamiseksi.