Menetelmän kehitys ja validointi lääkeaineen määrittämiseen biologisesta matriisista

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen oikeuskemian osastolle Helsingin toimipisteeseen. Työn tavoitteena oli kehittää kvantitatiivinen määritysmenetelmä enalaprilaatin pitoisuuksien määrittämiseen post mortem -verinäytteistä hyödyntämällä LC-MS/MS-massatekniikkaa. Opinnäytetyössä määritettiin lääkeaineelle optimaaliset massaspektrometriset olosuhteet, ja validoinnin perusteella selvitettiin menetelmän toimivuus. Enalaprilaatti on aihiolääkkeenä annettavan enalapriilin aktiivinen lääkeaine, joka metaboloituu imeytymisen jälkeen maksassa entsymaattisesti. Menetelmän kehityksessä enalaprilaatille selvitettiin parametrit, joilla on mahdollista tuottaa korkein intensiteetti tutkittavalle lääkeaineelle. Samalla tarkasteltiin analyytin fragmentoitumista massa-analysaattorilla positiivisella ionisaatiolla. Menetelmän kehityksen jälkeen suoritettiin esivalidointi ja validointi menetelmän toimivuuden tarkasteluun. Validoinnin yhteydessä tarkasteltiin myös vanhoja vainajanäytteitä, joilla on saavutettu positiivinen tulos enalapriililla. Tulosten perusteella saatiin tietoa enalaprilaatin oikeista pitoisuuksista PM-verinäytteissä. Validointitulosten perusteella toteamisrajan pitoisuudeksi saatiin 0,0002 mg/l ja määritysrajan pitoisuudeksi 0,0005 mg/l. Suhteellinen poikkeama molemmilla pitoisuustasoilla jäi alle 6 %:n, ja toistettavuusnäytteiden suhteellinen keskihajonta jäi alle 20 %:iin Näytteiden matriisivaikutus on suhteellisen suuri, mutta se ei vaikuta analyysitulokseen merkitsevästi, koska suhteellinen poikkeama odotusarvosta jää alle 10 %:n. Laajennetuksi mittausepävarmuudeksi saatiin 21 %. Validointitulokset vastasivat odotuksia ja täyttivät validointisuunnitelmassa asetetut vaatimukset. Todelliset vainajanäytteet asettuivat hyvin kalibrointisuoralle, ja menetelmä toimii hyvin enalaprilaatin määrittämiseen. Enalaprilaatti pidättyy C-18-kolonnissa epätasaisesti, mikä näkyy piikin epäsymmetrisyytenä. Siitä huolimatta analyysituloksen toistettavuus säilyy. Enalaprilaatti ei aiheuta häiriösignaaleja muihin määritysmenetelmän analyyttien kromatogrammeihin, eivätkä muut analyytit häiritse enalaprilaatin määrittämistä merkitsevästi.

The work was commissioned by the National Institute for Health and welfare in Helsinki. The aim of the work was to develop a suitable assay method for the determination of enalaprilat in postmortem blood samples by an LC-MS/MS mass analyzer. In the work, the optimized mass spectrometric conditions for the drug were determined and based on the validation, the functionality of the method was determined. Enalaprilat is the active drug of the prodrug enalapril, which is enzymatically metabolized in the liver after absorption. In the development of the method for Enalaprilat, the parameters that can produce the highest intensity of the drug of interest were elucidated. At the same time, the fragmentation of the analyte with positive ionization was examined by a mass analyzer. Following the development of the method, prevalidation and validation were performed to review the functionality. In addition, with validation old postmortem blood samples with a positive result with Enalapril were also examined. Based on the result of the blood samples, information was obtained on the correct concentrations of enalaprilat in real postmortem samples. Based on the validation results, the limit of detection was 0.0002 mg/l and the limit of quantification was 0.0005 mg/l. The relative deviation at both concentration levels was less than 6 %, and the relative standard deviation of the repeatability samples was less than 20 %. The expanded measurement uncertainty was 21 %. The matrix effect of the samples is relatively high, but it does not significantly affect the analytical result, as the relative deviation from the expected value is less than 10 %. The validation results correspond to the expectations and requirements of the validation plan. Actual postmortem samples settled well on the calibration line and the method is suitable for the determination of enalaprilat. Enalaprilat is unevenly retained on the C-18 column, which is reflected in the asymmetry of the peak. Nevertheless, the reproducibility of the analytical result remains. Enalaprilat does not interfere with the chromatograms of other analytes in the analytical method and other analytes do not significantly interfere with the determination of enalaprilat.