PINP:n eri varianttimuotojen tutkiminen

Abstract

Tyypin I prokollageenin aminoterminaalinen propeptidi (PINP) muodostuu tyypin I kollageenin synteesin aikana ja erittyy verenkiertoon. Seerumista mitattava intakti-PINP on heterotrimeerinen antigeeni, joka kuvaa luun aineenvaihduntanopeutta. PINP:n patologisen eli homotrimeerisen muodon on todettu liittyvän luukudoksen eri sairauksiin sekä luustoon etäpesäkkeitä lähettäviin syöpiin. Homotrimeeriselle antigeenille ei ole tarjolla spesifistä analysointimenetelmää, mikä hidastaa sen kliinisen merkityksen selvittämistä.

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia PINP:n eri varianttimuotoja leimattujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla. Tavoitteena oli optimoida sekä vasta-aineparien että tutkittavien antigeeninäytteiden pitoisuudet siten, että vasta-aineet sitoutuisivat spesifisesti joko heterotrimeeriseen tai homotrimeeriseen PINP-varianttiin. Analysoinneissa käytettiin Oulun yliopiston Diagnostiikan laitoksen Kliinisen kemian laboratoriossa olevaa IDS-iSYS-analysaattoria, jonka analysointimenetelmä perustuu vasta-aineeseen liitetyn merkkiaineen hajoamisessa emittoituvan valon määrän mittaamiseen (kemiluminesenssi).

Tutkittavat PINP-näytteet puhdistettiin pleura- ja askitesnesteistä kromatografisilla menetelmillä. Toimeksiantajan laboratoriossa aikaisemmin tehdyn tutkimuksen perusteella valitut vasta-aineet leimattiin joko biotiinilla tai akridiumesterillä. Vasta-aineiden pitoisuusoptimoinnin jälkeen leimaparien toimivuutta testattiin analysoimalla niiden sitoutuminen puhdistettuihin soluviljelynäytteisiin sekä denaturoituihin antigeeninäytteisiin. PINP-näytteiden puhtautta ja antigeenien rakennetta arvioitiin lisäksi geelielektroforeesin avulla.

Työn tuloksena saatiin optimoitua kolme erilaista vasta-aineparia, joilla mitattaessa PINP-näytteet titraantuivat tavoitteiden mukaisesti. Vasta-aineparit sitoutuivat hyvin soluviljelynäytteiden antigeeneihin, eli leimapareja on mahdollista käyttää apuna eri solulinjojen tutkimisessa. Vasta-aineiden sitoutuminen kohdeantigeeniin inhiboitui lämpödenaturoinnin seurauksena, eli menetelmä on herkkä antigeenin rakenteen muutoksille. Lisäksi työn aikana leimattujen vasta-aineiden todettiin olevan herkkiä pakastus-sulatussyklin toistumiselle. Työn tuloksia on mahdollista käyttää eri PINP-variantit erottelevan automaattisen analysointimenetelmän jatkokehityksessä ja pystytyksessä.

The aminoterminal propeptide of type I procollagen (PINP) is a trimeric antigen which is secreted into the blood circulation during collagen synthesis. In human serum PINP is mostly in a heterotrimeric form (so called intact PINP) and it is a clinically valid indicator for bone synthesis. In some pathological tissues like breast cancer or osteoarthrosis PINP is synthesized as a homotrimeric form which is weak and fragile compared to intact PINP. Present PINP immunoassays do not distinguish between the heterotrimeric and homotrimeric forms of the PINP antigen.

The purpose of this thesis was to study different variants of the PINP antigen and the structure of trimeric isoforms of the propeptide. The objective was to optimize the concentrations for monoclonal antibodies to bind spesifically either heterotrimeric or homotrimeric form of the antigen from the sample matrix.

PINP antigen samples were purified from human pleural and ascites fluid by cromatographic methods, and the purity of PINP samples was verified by gel electrophoresis. Monoclonal antibodies against different variants were either biotinylated or labeled with acridinium esther. Different samples were analyzed using automated IDS-iSYS-analyzer which assay method is based on the amount of light emitted by acridinium label of an antibody (chemiluminescence). The structure of antigens was studied by heat denaturation and gel electrophoresis.

After optimization the antigen-binding specificity of different antibody pairs was good. The antigen-binding ability was inhibited by heat denaturation so the method is sensitive to changes in antigen conformation. According to the results of gel electrophoresis the antigen samples were pure and the molecular weight of the polypeptide chains of PINP did not depend on the origin of the antigen. The results of this thesis can be used for establishing a new automated assay method for different PINP variants.