Bakteriofagitehtaan perustaminen
Vilkman, Virve (2022)
2022
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022112123390
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2022112123390
Tiivistelmä
Opinnäytetyön päätavoitteena olivat a) SARS-CoV-2:n malliviruksen ja Pseudomonas syringae pv. phaseolicola-bakteerikantaa infektoivan bakteriofagi φ6:n tuotantomenetelmän perustaminen Metropolia Ammattikorkeakoulun Myyrmäen kampuksen mikrobiologian laboratorion käyttöön sekä b) laatia menetelmästä työohje, jonka avulla saataisiin muodostettua laboratoriotyökerta laboratorioanalytiikan opiskelijoille. Lisäksi tarkasteltiin menetelmän soveltuvuutta Antivirus-koronateipin antiviraalisuuden arvioimiseen sekä UVC-pintadesinfiointikaapin toiminnan testaamiseen.
Opinnäytetyön aikana kehitettiin kaksikerrosmaljaukseen perustuva menetelmä bakteriofagin infektiivisyyden eli tiitterin laskentaan. Menetelmässä jähmetetyn pohja-agarin pinnalle valetaan sulan pehmytagarin ja bakteeri-fagisuspension seos, jonka annetaan jähmettyä ja jota inkuboidaan käytetylle bakteerille sopivassa lämpötilassa 18 tunnin ajan. Tuona aikana muodostuvat plakit laskettiin, mistä yhtälömuodossa laskettuna saatiin selville fagistokin tiitteri. Korkean tiitterin omaavalta fagilaimennostason maljalta poimittiin yksittäin plakkeja SM-puskuriin. Seos vorterksoitiin, sentrifugoitiin ja steriilisuodatettiin. Tällöin saatiin muodostettua bakteriofagistokki, jota voitiin käyttää myöhemmin fagilaimennossarjan kantaliuoksena. Tiitterin pysyvyyttä ajan funktiona seurattiin kuukausittain toistuvilla kaksikerrosmaljauksilla ja tiitterin määrityksillä sekä kylmiössä säilytetystä että pakastetusta fagistokista.
Kuuden kuukauden säilytyksen aikana bakteriofagin tiitteri pysyi suhteellisen samalla tasolla sekä kylmiössä säilytettynä että pakastettuna, ollen pääsääntöisesti välillä 1,2 – 2,5 x 10^8 PFU/ml. Antivirus-koronateipin antiviraalisuutta testatessa havaittiin ongelmia φ6-fagin elvyttämisessä erityisesti muovipinnalla. Tästä syystä tilalle vaihdettiin bakteriofagi T7, joka on Escherichia coli-bakteeria infektoiva fagi. Antivirus-koronateipin antiviraalisuus saatiin määritettyä T7 - E. coli-kombinaatiolla. UVC-pintadesinfiointikaapin steriloivaa vaikutusta testattiin sekä φ6- että T7-fageilla. Tulokset olivat yhtenevät valmistajan ilmoittaman sterilointitehon kanssa.
Opinnäytetyön aikana kehitettiin kaksikerrosmaljaukseen perustuva menetelmä bakteriofagin infektiivisyyden eli tiitterin laskentaan. Menetelmässä jähmetetyn pohja-agarin pinnalle valetaan sulan pehmytagarin ja bakteeri-fagisuspension seos, jonka annetaan jähmettyä ja jota inkuboidaan käytetylle bakteerille sopivassa lämpötilassa 18 tunnin ajan. Tuona aikana muodostuvat plakit laskettiin, mistä yhtälömuodossa laskettuna saatiin selville fagistokin tiitteri. Korkean tiitterin omaavalta fagilaimennostason maljalta poimittiin yksittäin plakkeja SM-puskuriin. Seos vorterksoitiin, sentrifugoitiin ja steriilisuodatettiin. Tällöin saatiin muodostettua bakteriofagistokki, jota voitiin käyttää myöhemmin fagilaimennossarjan kantaliuoksena. Tiitterin pysyvyyttä ajan funktiona seurattiin kuukausittain toistuvilla kaksikerrosmaljauksilla ja tiitterin määrityksillä sekä kylmiössä säilytetystä että pakastetusta fagistokista.
Kuuden kuukauden säilytyksen aikana bakteriofagin tiitteri pysyi suhteellisen samalla tasolla sekä kylmiössä säilytettynä että pakastettuna, ollen pääsääntöisesti välillä 1,2 – 2,5 x 10^8 PFU/ml. Antivirus-koronateipin antiviraalisuutta testatessa havaittiin ongelmia φ6-fagin elvyttämisessä erityisesti muovipinnalla. Tästä syystä tilalle vaihdettiin bakteriofagi T7, joka on Escherichia coli-bakteeria infektoiva fagi. Antivirus-koronateipin antiviraalisuus saatiin määritettyä T7 - E. coli-kombinaatiolla. UVC-pintadesinfiointikaapin steriloivaa vaikutusta testattiin sekä φ6- että T7-fageilla. Tulokset olivat yhtenevät valmistajan ilmoittaman sterilointitehon kanssa.