Characterization of microbial xylanases

Abstract

Tämä insinöörityö tehtiin toimeksiantona Teknologian tutkimuskeskus VTT Oy:lle entsyymi- ja materiaalibiotekniikan tiimissä, ja osana Euroopan unionin EUNextGeneration-rahoitusvälineen kautta Suomen Akatemian rahoittamaa MIMIC-hanketta (apurahanumero 347612). Hankkeen tavoitteena on soveltaa mikroskopiaa ja koneoppimista lignoselluloosamateriaalien molekyylikuvauksessa, ja siihen kuuluu myös erilaisten entsyymien ominaisuuksien ja niiden lopputuotteiden selvittäminen perinteisiä menetelmiä hyödyntäen.

Ksylanaasit ovat ksylaania hajottavia hydrolaasientsyymejä, joiden on osoitettu soveltuvan laajasti käytettäväksi eri teollisissa sovelluksissa, kuten massa- ja paperiteollisuudessa, elintarvike- ja rehuteollisuudessa sekä biopolttoaineteollisuudessa. Kiinnostus etsiä teollisuuden kannalta ominaisuuksiltaan merkityksellisiä ksylanaaseja on lisääntynyt kasvavan kysynnän vuoksi.

Työn tavoitteena oli karakterisoida 24:n eri mikro-organismeista peräisin olevan ksylanaasin biokemialliset ominaisuudet. Ksylanaasien valinta ja valmistus Trichoderma reesei -sienessä oli tapahtunut ennen tämän työn aloitusta. Ksylanaasien tutkimisessa keskityttiin entsyymiaktiivisuuden, substraattispesifisyyden, pH-optimin, lämpöstabiiliuden sekä proteiinipitoisuuden tutkimiseen. Aktiivisuutta analysoitiin kolmella eri substraatilla ja sitä mitattiin spektrofotometrisesti analysoimalla optista tiheyttä sekä pelkistäviä sokereita kahdella kolorimetrisellä menetelmällä. Työn edetessä aktiivisuusanalyysejä kehitettiin ja niiden välistä korrelaatiota tutkittiin.

Tulosten perusteella vain kolorimetristen menetelmien välillä havaittiin korrelaatiota. Tutkimus antoi paremman käsityksen tutkittavista ksylanaaseista. Yksi kanta oli stabiili jopa 80 ℃:n lämpötiloissa ja muutama 70 ℃:ssa. Yleisesti aktiivisuutta havaittiin kaikissa pH-arvoissa 3,5–8. Lisätutkimuksia tarvitaan näiden kantojen täydelliseen tutkimiseen toistomittausten, puhdistamisen tai massaspektrometrian avulla. Tulosten pohjalta löydettiin useampi teollisesti merkittävä ksylanaasi, joita voidaan hyödyntää VTT:n tulevissa projekteissa.

This thesis was completed at VTT Technical Research Centre of Finland Ltd within the Enzyme and Material Biotechnology Team, and as a part of MIMIC project, which received funding from the European Union – NextGenerationEU instrument and is funded by the Academy of Finland under grant number 347612. The MIMIC-project aims to apply microscopy and machine learning in molecular characterization of lignocellulosic materials, part of which is the characterization of various enzymes and their end products using conventional methods.

Xylanases are xylan-degrading hydrolase enzymes that have been proven suitable to be widely used in industrial applications such as pulp and paper, food and feed, and biofuel industries. There has been an increased interest in discovering xylanases with specific industrial properties due to a growing market demand.

The aim of this thesis was to characterize the biochemical properties of 24 different novel xylanases originating from different micro-organisms that, prior to this thesis, had been heterologously expressed in a filamentous fungus Trichoderma reesei. The characterization focused on enzymatic activity, substrate specificity, pH optima, thermostability and protein content of the studied xylanases. The enzymatic activity was analyzed using three different substrates and measured spectrophotometrically by analyzing hydrolysis via optical density -based assay and reducing sugars by two colorimetric methods. In addition, the activity assays were developed and possible correlation between them was evaluated.

According to the results of this thesis, correlation was only found between the colorimetric methods. Characterization of the novel xylanases provided a better understanding of their properties. One strain was stable at temperatures up to 80 ℃ and a few up to 70 ℃. Varying activity across all the pHs of 3.5–8 was discovered. Further research is needed to demonstrate the full potential of these strains by repetition, purification, or mass spectrometry. On the basis of these results, a couple of xylanases with industrially relevant qualities were discovered which can be selected for future projects at VTT.