Profiling of Cloudberry Cell Cultures by Applying Metabolomics

Abstract

This thesis project was carried out for VTT Technical Research Center of Finland. The aim of the thesis was to look into possibilities of applying the instrumentation used in metabolomics into profiling berry cell cultures. The main focuses were to test a few general solvent extraction methods on berry cells and evaluating how fitting GC-GC-TOFMS analytics would be when it comes to analyzing such sample matrices.

The project was first set to cover a total of six different berries. After the initial test runs and due to time limits however, it was decided that it would be best to focus merely on cloud-berry cell culture samples. There were difficulties in figuring out a proper extraction method since the berry cell culture samples were very fatty and contained high amounts of sugars. The main issue with the extraction was to eliminate the excess of carbohydrates which hindered the profiling of the main compounds of interest.

The work was carried out by preparing successive sample sets in a manner that the preparation of each set would be an improvement over the one before. Such specifics were altered as sample amount and most importantly solvent composition. Set by set it became clear that most culture samples would require more work when it came to figuring out a proper solvent and purification. Cloudberry was chosen as the most simple and useful matrix on the basis of GCxGC-TOFMS chromatograms.

Final results from the time-of-flight detector indicated that several factors such as finding suitable internal standards and establishing sensible dilutions to perform accurate calibrations and have them studied before a reliable method for metabolomics can be developed.

Tämä opinnäytetyö tehtiin Teknologian tutkimuskeskukselle VTT:lle. Työn tarkoituksena oli aloittaa laitoksen projekti, jossa sovellettaisiin metabolomiikassa käytettäviä analyyttisiä menetelmiä marjasoluviljelmien koostumuksen selvittämiseen. Päällimmäisinä tavoitteina projektissa oli testata muutamalla eri liuottimella uuttaen marjasolunäytteitä ja kokeilla, soveltuisiko GCxGC-TOFMS -laitteisto tällaisten matriisien analysoimiseen.

Alustavasti työssä oli tarkoitus testata kuutta eri marjalajia, mutta lopulta tutkimus tehtiin lakan soluviljelmillä aikarajoituksien takia. Työn kannalta keskeisimpiä ongelmia olivat sopivan uuttomenetelmän löytämisen lisäksi näytteiden suuresta sokeripitoisuudesta aiheutuvien analyyttisten ongelmien eliminointi.

Työ suoritettiin yritys-erehdys -periaatteella. Näytesarjoja valmistettiin yhteensä seitsemän, joista jokaisen valmistuksessa pyrittiin korjaamaan edellisen virheet ja kehittämään menetelmää entisestään. Menetelmissä muokattiin yksityiskohtia, kuten uuttoliuoksen koostumusta ja -suhteita solukkomääriin verrattuna. Vähitellen kävi ilmi, että eri marjalajeille olisi kehitettävä omakohtaiset uutto-olosuhteet ja esikäsittelyt. Näiden kokeiden perusteella lakka valittiin sopivimmaksi tutkimuskohteeksi.

Tulokset osoittivat, että näytteenvalmistus, esimerkiksi sokereiden poistaminen näytteistä ja kvantitointiin liittyvien parametrien optimoiminen vaatisivat vielä runsaasti kehitystyötä. Tämän työn puitteissa saatiin kuitenkin tärkeää perustietoa marjasoluviljelmien koostumuksesta ja analyyttisistä kehityskohteista.