Fluoresoivan eksonukleaasimenetelmän kehittäminen
Silmunen, Tua (2023)
2023
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2023112832468
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2023112832468
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää toimeksiantajayrityksen käyttöön menetelmä, jonka avulla eksonukleaasipitoisuusmääritykset voidaan tehdä ilman radioaktiivisten aineiden käyttöä. Käytössä olevalla menetelmällä eksonukleaasipitoisuudet määritetään radioaktiivisesti leimattujen DNA-substraattien avulla nestetuikeilmaisimella. Työssä tutkittiin kehitetyn menetelmän toimivuutta sekä optimoitiin menetelmän parametrejä.
Aikaisempien tutkimusten perusteella tarkasteltiin fluoresoivan menetelmän soveltuvuutta eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamiseksi. Eksonukleaasien tunnistamiseen käytettiin kaksoisleimattuja Molecular Beacon -koettimia ja positiivikontrolleina käytettiin kaupallisia eksonukleaaseja sekä Taq-DNA-polymeraasia. Näytteiden fluoresenssitason muutokset määritettiin qPCR-ajolla. Menetelmäkehityksessä tutkittuja parametrejä olivat kaupallisten eksonukleaasien entsyymimäärä, Molecular Beacon -koettimien pitoisuus, kuumasaumaajan käyttö kuoppalevyn sulkemisessa, reaktioiden lineaarinen alue sekä Calf thymus DNA:n lisäys reaktioihin. Lisäksi fluoresoivan menetelmän tuloksia verrattiin käytössä olevaan radioaktiiviseen menetelmään.
Fluoresoiva eksonukleaasimenetelmä antoi selkeät vasteerot negatiivi- ja positiivikontrollien välille. Lisäksi yrityksen kahden eri tuotteen, jotka eivät tutkitusti omaa eksonukleaasiaktiivisuutta, vasteet jäivät negatiivikontrollien tasolle. Todettiin, että tuotteet eivät aiheuta väärää positiivista reaktiota fluoresoivalla eksonukleaasimenetelmällä. Molecular Beacon -koetinseoksen tausta häiritsi eksonukleaaseista syntyvän vasteen näkymistä, kun käytettävät koetinpitoisuudet olivat suuret. Kun reaktioissa käytettiin yksittäisiä koettimia, eri eksonukleaasipitoisuuksien väliset erot olivat selkeämmät. Tämän lisäksi rinnakkaisnäytteiden hajonta oli vähäisempää. Eri Taq-DNA-polymeraasipitoisuuksien fluoresenssitasoissa ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja. Positiivikontrolleille ei näin ollen pystytty määrittämään selkeitä kriteerejä. Reaktioilla ei ollut selkeää lineaarista aluetta. Lisäksi kaupallisten eksonukleaasi-entsyymierien väleillä oli huomattavasti hajontaa sekä radioaktiivisella että fluoresoivalla menetelmällä.
Fluoresoivalle menetelmälle ei voitu asettaa samanlaisia kriteerejä kuin radioaktiivisella menetelmällä on ollut käytössä. Tämänlaisena fluoresoivasta menetelmästä ei saatu yritykselle korvaavaa menetelmää, mutta tulokset antavat hyvän pohjan jatkotutkimuksille esimerkiksi täysin kvalitatiivisesta menetelmästä.
Aikaisempien tutkimusten perusteella tarkasteltiin fluoresoivan menetelmän soveltuvuutta eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamiseksi. Eksonukleaasien tunnistamiseen käytettiin kaksoisleimattuja Molecular Beacon -koettimia ja positiivikontrolleina käytettiin kaupallisia eksonukleaaseja sekä Taq-DNA-polymeraasia. Näytteiden fluoresenssitason muutokset määritettiin qPCR-ajolla. Menetelmäkehityksessä tutkittuja parametrejä olivat kaupallisten eksonukleaasien entsyymimäärä, Molecular Beacon -koettimien pitoisuus, kuumasaumaajan käyttö kuoppalevyn sulkemisessa, reaktioiden lineaarinen alue sekä Calf thymus DNA:n lisäys reaktioihin. Lisäksi fluoresoivan menetelmän tuloksia verrattiin käytössä olevaan radioaktiiviseen menetelmään.
Fluoresoiva eksonukleaasimenetelmä antoi selkeät vasteerot negatiivi- ja positiivikontrollien välille. Lisäksi yrityksen kahden eri tuotteen, jotka eivät tutkitusti omaa eksonukleaasiaktiivisuutta, vasteet jäivät negatiivikontrollien tasolle. Todettiin, että tuotteet eivät aiheuta väärää positiivista reaktiota fluoresoivalla eksonukleaasimenetelmällä. Molecular Beacon -koetinseoksen tausta häiritsi eksonukleaaseista syntyvän vasteen näkymistä, kun käytettävät koetinpitoisuudet olivat suuret. Kun reaktioissa käytettiin yksittäisiä koettimia, eri eksonukleaasipitoisuuksien väliset erot olivat selkeämmät. Tämän lisäksi rinnakkaisnäytteiden hajonta oli vähäisempää. Eri Taq-DNA-polymeraasipitoisuuksien fluoresenssitasoissa ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja. Positiivikontrolleille ei näin ollen pystytty määrittämään selkeitä kriteerejä. Reaktioilla ei ollut selkeää lineaarista aluetta. Lisäksi kaupallisten eksonukleaasi-entsyymierien väleillä oli huomattavasti hajontaa sekä radioaktiivisella että fluoresoivalla menetelmällä.
Fluoresoivalle menetelmälle ei voitu asettaa samanlaisia kriteerejä kuin radioaktiivisella menetelmällä on ollut käytössä. Tämänlaisena fluoresoivasta menetelmästä ei saatu yritykselle korvaavaa menetelmää, mutta tulokset antavat hyvän pohjan jatkotutkimuksille esimerkiksi täysin kvalitatiivisesta menetelmästä.