Troubleshooting the Workflow of a Next-Generation Sequencing Library Preparation

Abstract

Sequencing-based methods, especially bacterial 16S ribosomal RNA gene amplicon analysis are widely used when studying complex microbial communities. Preparing libraries for Illumina NGS platforms includes multiplying the targeted area of the gene with universal bacterial primers and attaching Illumina-compatible P5 and P7 tails to the amplicons.

This thesis project was done in a research group that has generated high-throughput microbiome data with NGS technology from over 10 000 samples using the 16S rRNA gene. The research group has lately experienced varying quality in their NGS results. The aim of this study was to identify and troubleshoot possible sources for the challenges focusing mainly on the workflow for preparing the NGS libraries.

During the thesis study a few issues in the workflow were identified. A dilution factor error on a formula counting DNA concentration was found. It has likely influenced the effectiveness of PCR and caused forming of primer-dimers. Inspection of the paramagnetic bead-based library purification protocol revealed low recovery percentages of DNA independent of the used conditions. The recovery percentage was slightly improved by changing to a higher bead to sample -ratio. In library quantification, the attachment rate of the Illumina-compatible P5 and P7 -tails in the prepared libraries was found to be low. Using two separate PCR reactions to prepare the libraries improved the attachment rate, but not to a satisfactory level. The reason behind the low attachment rate requires further work. Finally, the length of the NGS libraries was found out to be shorter than expected, indicating a possible problem with the PCR.

Sekvensointipohjaiset menetelmät ovat suosittuja monimutkaisten mikrobiyhteisöjen tutkimiseen. Yleisimmin käytössä oleva tekniikka on bakteerien 16S ribosomaalisen RNA-geenin monistustuotteiden analyysi. Kirjastojen valmistamiseen Illumina-alustoille kuuluu kohdealueen monistaminen universaalialukkeilla ja Illumina-yhteensopivien P5- ja P7-häntien kiinnittäminen amplikoneihin.

Opinnäytetyö tehtiin tutkimusryhmässä, jossa on analysoitu yli 10 000 mikrobistonäytettä NGS-tekniikan avulla hyödyntäen 16S rRNA -geeniä. Tutkimusryhmällä on viime aikoina ollut haasteita NGS-tulosten laadun vaihtelun kanssa. Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää mahdollisia ongelmanlähteitä keskittyen pääosin NGS-kirjastojen valmistukseen liittyviin työvaiheisiin.

Työn aikana havaittiin haasteita useissa työvaiheissa. Laboratorion DNA:n konsentraatiota laskevasta kaavasta löydettiin laimennoskerroinvirhe, joka on todennäköisesti vaikuttanut PCR:n tehokkuuteen ja alukkeiden pariutumiseen keskenään. Kirjastojen puhdistusprotokollaa testatessa havaittiin, että paramagneettisiin helmiin pohjautuvan puhdistuksen aikana DNA:ta häviää odotettua enemmän olosuhteista riippumatta. DNA:n saantoprosenttia saatiin hieman parannettua muuttamalla helmien ja näytteen välistä suhdetta korkeammaksi. Kirjastojen laatua tutkittaessa Illumina-yhteensopivien P5- ja P7-häntien kiinnittymisaste havaittiin heikoksi. Kirjastojen valmistaminen kahdella erillisellä PCR-reaktiolla paransi kiinnittymisastetta, mutta ei tyydyttävälle tasolle. Syy alhaiseen kiinnittymisasteeseen vaatii lisätutkimusta. Lisäksi kirjastojen koko havaittiin lyhyemmäksi kuin odotettiin, mikä saattaa johtua ongelmista PCR:n aikana.