LAMP-2B-proteiinin mutaatioiden vaikutus kolesterolin ja BMP:n kertymiseen nisäkässoluissa

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston Biotieteiden laitoksella Eeva-Liisa Eskelisen tutkimusryhmässä.

Tietynlaisten glysiinejä sisältävien aminohapposekvensseien on osoitettu vaikuttavan transmembraaniproteiinien välisissä interaktioissa. Lysosomaalisen membraaniproteiini LAMP-2B:n transmembraanialueelle tehtiin mutaatioita PCR-reaktioilla käyttäen alukkeita, joilla alueelta muutettiin kolme glysiiniä valiineiksi. Amplikonit yhdistettiin ja liigoitiin pCI-neo-vektoriin, joka transformoitiin E. coliin. Pesäkkeistä eristettiin plasmidit, jotka seulottiin halutun insertin sisältävän löytämiseksi.

Plasmidi transfektoitiin LAMP-1- ja LAMP-2-kaksoispoistogeenisiin hiiren alkion sidekudossoluihin ilmentymään. Solut immunovärjättiin LAMP-, LIMP- ja BMP-vasta-aineilla, fluoresoivilla sekundäärisillä vasta-aineilla sekä Filipinillä. Mutatoitua proteiinia ilmennettiin myös HeLa-soluissa.

Western blotin perusteella voitiin todeta mutatoidun proteiinin olevan saman kokoinen kuin mutatoimatonkin. Mikroskooppikuvien perusteella ei voitu sanoa mitään varmaa näytteiden pienen määrän ja tulosten suuren keskihajonnan vuoksi. Vertailemalla LAMP:n, BMP:n ja LIMP:n kolokalisaatiota havaittiin, etteivät LAMP ja BMP kolokalisoidu LIMP:n kanssa, mikä saattaa olla yksi syy mikroskooppikuvien tulosten suureen keskihajontaan.

This thesis was made in Eeva-Liisa Eskelinen’s research group in the Department of Biosciences of the University of Helsinki.

Certain amino acid sequences containing glysines have been shown to have have an effect on protein-protein interactions between transmembrane proteins. The transmembrane re-gion of the lysosomal membrane protein LAMP-2B was mutated by PCR with primers that changed three glysines to valines. The amplicones were joined together and the product was transformed to E. coli. Plasmid DNA was isolated from the colonies and the samples were screened for discovery of the wanted insert.

The plasmid was transfected to and expressed in LAMP-1 and LAMP-2 double deficient MEF cells. The cells were stained with Filipin, with antibodies for LAMP-2, LIMP and BMP and with secondary fluorescent antibodies. The mutated protein was also expressed in HeLa cells.

The mutated protein was discovered to be of the same size with the unmutated protein by a Western blot analysis. No conclusions could be made based on the microscopy images due to the low number of samples and a high standard deviation in the results. By compar-ing the colocalization of LAMP, BMP and LIMP, it was discovered that LAMP and BMP do not colocalize with LIMP, which may be one of the reasons for a high standard deviation in the results from the microscopy images.