Nopean autovasta-ainemäärityksen optimointi diabetes autovasta-ainepositiivisten elinluovuttajien tunnistamiseksi

Abstract

Tyypin 1 diabetes (T1D) on autoimmuunisairaus, jossa haiman insuliinia tuottavien beetasolujen tuhoutumisen myötä verenkiertoon ilmestyy autovasta-aineita haiman beetasolujen eri proteiineja vastaan. Näistä merkittävimpiä ovat autovasta-aineet insuliinia- (IAA), gluta-miinihappodekarboksylaasia- (GADA), saarekesoluantigeenia- 2- (IA-2A) ja sinkin kuljetusmolekyylia 8 (ZnT8A) vastaan.

Työn tarkoituksena oli kehittää ja optimoida nopea määritysmenetelmä GADA-, IA-2A- ja ZnT8A vasteiden määrittämiseksi, jolloin saisimme lyhyemmässä ajassa tietoa, onko elinluovuttajien seerumissa diabetekseen liittyviä autovasta-aineita. Tavoitteena oli saada kaikki kolme autovasta-ainetta analysoiduksi noin kahdessa tunnissa siten, että tieto elinluovuttajan T1D autovasta-aineista on selvillä haiman saapuessa Uppsalan yliopiston saarekelaboratorioon noin klo 9:00 aamulla Suomen aikaa. Näin saisimme elinluovuttajan haiman tarkoituksenmukaiseen jatkokäsittelyyn.

Tutkimus suoritettiin Helsingin yliopiston Lastenklinikan tieteellisessä laboratoriossa. Näyte-aineistona olivat Lasten diabetesrekisterin seeruminäytteet. Käytössä olevaa radioimmuno-logista menetelmää (RBA) optimoitiin mm nostamalla inkubaatiolämpötilaa 4°C:sta huo-neenlämpöön ja lyhentämällä yli yön inkubaatiota 40 minuutiksi. ELISA tehtiin ensin valmis-tajan (RSR) ohjeiden mukaisesti, sitten menetelmää muokattiin mm. lyhentämällä inkubaatioaikoja 20 minuutiksi ja nostamalla inkubaatiolämpötilaa.

Tulokset osoittivat nopean ja standardi RBA- menetelmän tuloksien vastaavan toisiaan. Ainoastaan positiivisuuden rajalla olevilla arvoilla oli vaihtelua positiivisuuden suhteen. ELISA tulokset olivat yhdenmukaisia keskenään ja RBA:n kanssa. Tulokset osoittavat, että kaikki kolme T1D autovasta-ainetta pystytään analysoimaan noin kahdessa tunnissa sekä RBA- että ELISA menetelmillä ja tulokset korreloivat hyvin standardimenetelmillä saatuihin tuloksiin ja soveltuvat täten elinluovuttajien T1D autovasta-aineiden nopeaan analysointiin.

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease arising from the destruction of the insulinproducing beta-cells in the pancreatic islets. The appearance of islet cell specific autoantibodies towards beta cell antigens such as glutamic acid decarboxylase (GADA), insulin (IAA), insulinoma-associated antigen-2 (IA-2) and zinc transporter-8 (ZnT8A) are the first detectable markers of the destructioveprocess.

The current study set out to develop rapid assays for autoantibodies to GADA, IA-2A and ZnT8A by modifications of both our standard radiobinding assay (RBA) and a commercial ELISA. Our preliminary aim was to get all three autoantibody results within 2 hours, i.e. before the processing of the organ donors’ pancreata in the islet isolation laboratory, Uppsala University. Various histological samples and RNA are taken from the pancreas of autoantibody-positive subjects in order to understand the mechanisms of beta-cell destruction.

The study was performed in the Scientific Laboratory, Children’s Hospital, University of Helsinki. Serum samples were from the National Pediatric Diabetes Register. The RBA was modified into a rapid assay by incubating the labeled antigens and serum for 40 minutes at RT instead of overnight at 4 °C. Immune complexes were bound to Protein-A Sepharose at RT for 20 minutes. Further, antigen labels were made ready, standards and controls were pipetted on plates on beforehand and all were kept at -80 ºC. The RSR ELISAs were first performed according to the manufacturer’s instructions. Then assays were modified by shortening the incubation times to 20 minutes and all incubations performed at RT.

The results showed a strong consistence for medium titers and negative responses, but RBA results close to cut-off values showed some discrepancies. ELISA results were more consistent. Our results indicate that all three (IA-2A, GADA and ZnT8A) RSR ELISA assays can be accomplished within 2 hours and the results correlate well with results obtained according to the manufacture’s instructions. All three RBA assays can be performed in about 2 hours and the results correlate well with conventional assays and are in good concordance with the ELISA results.

We can exploit rapid assays for detection of type1 diabetes-associated autoantibodies in organ donors.