Product Development of a KASP Genotyping Assay-Based Commercial Genetic Test for Canine Degenerative Myelopathy

Abstract

Yli 300 mendelistisesti periytyvää koiran (Canis lupus familiaris) sairautta on löydetty. Koirien perinnöllisiin sairauksiin on tällä hetkellä saatavilla yli 200 geenitestiä ja koirien DNA-testausmarkkinoiden ennustetaan kasvavan tulevaisuudessa. Tämän insinöörityön tavoitteena oli luoda puitteet eläingeenitestien kehitykselle ja kehittää ensimmäinen kaupallinen, suoraan kuluttajalle suunnattu eläingeenitesti in vitro -diagnostiikkaan (IVD) erikoistuneelle Medigoo Oyj:lle.

Geenitesti kehitettiin degeneratiiviseen myelopatiaan (DM), koirien selkäydinrappeumasairauteen, joka on yhdistetty yhden nukleotidin polymorfismiin (eng. single-nucleotide polymorphism, SNP) superoksididismutaasi 1 -geenissä (SOD1) (c.118G>A, p.E40K). Testi pohjautui kilpailevaan alleelispesifiseen PCR (KASP) -menetelmään, jolla voidaan genotyypittää DNA-näytteitä kahden alleelin suhteen. Kirjallisuuskatsauksessa selvitettiin eläingeenitesteihin liittyvä lainsäädäntö, koirien genomitietokanta ja testin toteutettavuus KASP:lla. Lisäksi selvitystä tehtiin DM:n oirekuvasta, geneettisestä perustasta sekä taudin ja tautialleelien esiintyvyydestä eri roduilla. Koirien poskisolunäytteille luotiin näytteenotto-ohjeet. SOD1:c.118G>A-alleelien genotyypitykseen tarkoitettua KASP-analyysia testattiin 13 eri koiranäytteellä. Koirista kerättiin rinnakkaisnäytteet ja DNA eristettiin kahdella eri menetelmällä: Protokolla 1:tä (P1) oli aiemmin käytetty ihmisen DNA:n eristykseen poskisolunäytteistä ja se oli lyhennetty versio alkuperäisestä eristyskitin menetelmästä, protokolla 2:sta (P2). Protokollia vertailtiin DNA:n saannon, puhtauden ja KASP-suorituskyvyn suhteen.

Vain pitoisuudessa havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero P2:n eduksi. KASP-analyysi toimi tarkoitetulla tavalla, oli toistettavissa ja kaikille koirille voitiin määrittää genotyypit.

Over 300 Mendelian diseases of the dog (Canis lupus familiaris) have been identified. Over 200 genetic tests for canine disorders are currently available worldwide and the global dog DNA testing market is expected to grow in the future. This bachelor's thesis aimed to establish a framework for the development of animal genetic tests and develop the first commercial, direct-to-consumer, animal-targeted genetic test for Medigoo Oyj Inc., a company specializing in in vitro diagnostics (IVD).

A genetic test for degenerative myelopathy (DM), a neurogenerative disease found in dogs associated with single-nucleotide polymorphism (SNP) in superoxide dismutase 1 gene (SOD1) (c.118G>A, p.E40K), was developed. The test utilized Competitive Allele-Specific PCR (KASP), a method that can be used to genotype DNA samples in relation to two alleles. A literature review was done on the regulations for animal genetic tests, the genomic database for dogs, clinical signs, genetic basis, epidemiology, and population genetics for DM, and the feasibility of the test with KASP. A sample collection protocol for dog buccal swab samples was created. The KASP assay for detecting the alleles of SOD1:c.118G>A was tested with 13 different dog samples. Duplicate samples were collected from each dog. DNA was isolated with two protocols: Protocol 1 (P1) had previously been used with human buccal swab samples at Medigoo and was a shortened version of the original isolation kit’s protocol, Protocol 2 (P2). The protocols were compared for differences in DNA yield, purity, and performance in KASP.

Only statistically significant difference was found in concentration in favor of P2. The KASP genotyping assay worked as intended, was repeatable, and genotypes could be determined for all dogs.