Tangentiaalisen ultrasuodatuksen ja differentiaalisen ultrasentrifugoinnin konsentrointitehokkuuden vertailu Ф6-bakteriofaagin avulla
Roininen, Teemu (2024)
2024
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2024052615789
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2024052615789
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia suurten makromolekyylien konsentroitumiskäyttäytymistä tangentiaalisessa ultrasuodatuksessa ja differentiaalisessa ultrasentrifugoinnissa. Tämän lisäksi työssä haluttiin määrittää, kumpi menetelmä on kustannustehokkaampi näytteiden konsentroinnissa.
Makromolekyylien mallina käytettiin puhdistettua Ф6-bakteriofaagia. Ф6 on lipidivaipallinen dsRNA-bakteriofagi. Sen ulkohalkaisija on 85 nm ja MW 9,9·10^4 kDa. Konsentrointianalyyseissa Ф6-viruksesta tehtiin laimennoksia, joita käytettiin näytteinä 100 kDa RC Amicon Ultra-4- ja 100 kDa PES Vivaspin 6 -konsentraattoreissa. Konsentroitumista tutkittiin myös Thermo Scientific Sorvall wX+ Ultra -ultrasentrifugin uudella Fiberlite F50L-24 x 1,5 -roottorilla eri kierrosnopeuksien ja sentrifugointiaikojen yhdistelmillä. Menetelmien konsentrointitehokkuus määritettiin ensisijaisesti konsentraattien viruspitoisuuksien (PFU/ml) ja saantojen (PFU, %) avulla.
Konsentraattoreilla loppupitoisuus ja saanto laskivat lähtöpitoisuuden laskiessa. RC-membraani on noin 2 kertaa tehokkaampi konsentroinnissa kuin PES-membraani. Kun lähtöpitoisuus on noin 10^10–10^11 PFU/ml, näytteet voidaan konsentroida Amicon-konsentraattoreilla 15x-pitoisuuteen yli 80 %:n saannossa ja Vivaspin-konsentraattoreilla noin 9x-pitoisuuteen 50 %:n saannossa. Kun lähtöpitoisuus on noin 10^9–10^10 PFU/ml, näytteet voidaan konsentroida Amicon-konsentraattoreilla noin 4x-pitoisuuksiin 15–30 %:n saannossa ja Vivaspin-konsentraattoreilla 2x-pitoisuuksiin 10 %:n saannossa. Lähtöpitoisuuden ollessa 10^8–10^9 PFU/ml saannot ovat molemmilla konsentraattoreilla <1 %. F50L-roottorin konsentrointitehokkuus on suurempi kuin konsentraattoreilla, ja se on yhtä suuri lähtöpitoisuuksien 8,1·10^10 ja 2,4·10^9 PFU/ml sekä testattujen olosuhteiden kesken: konsentraattien saannot ovat keskimäärin yli 80 % ja loppupitoisuudet noin 5,2x lähtöpitoisuuksiin nähden. F50L-roottorilla olosuhde 15 min, 35 000 rpm riittää Ф6-näytteiden konsentrointiin. Jos laboratoriossa voidaan käyttää ultrasentrifugilaitteistoja, F50L-roottori on konsentraattoreita kustannustehokkaampi näytteiden konsentroinnissa.
Makromolekyylien mallina käytettiin puhdistettua Ф6-bakteriofaagia. Ф6 on lipidivaipallinen dsRNA-bakteriofagi. Sen ulkohalkaisija on 85 nm ja MW 9,9·10^4 kDa. Konsentrointianalyyseissa Ф6-viruksesta tehtiin laimennoksia, joita käytettiin näytteinä 100 kDa RC Amicon Ultra-4- ja 100 kDa PES Vivaspin 6 -konsentraattoreissa. Konsentroitumista tutkittiin myös Thermo Scientific Sorvall wX+ Ultra -ultrasentrifugin uudella Fiberlite F50L-24 x 1,5 -roottorilla eri kierrosnopeuksien ja sentrifugointiaikojen yhdistelmillä. Menetelmien konsentrointitehokkuus määritettiin ensisijaisesti konsentraattien viruspitoisuuksien (PFU/ml) ja saantojen (PFU, %) avulla.
Konsentraattoreilla loppupitoisuus ja saanto laskivat lähtöpitoisuuden laskiessa. RC-membraani on noin 2 kertaa tehokkaampi konsentroinnissa kuin PES-membraani. Kun lähtöpitoisuus on noin 10^10–10^11 PFU/ml, näytteet voidaan konsentroida Amicon-konsentraattoreilla 15x-pitoisuuteen yli 80 %:n saannossa ja Vivaspin-konsentraattoreilla noin 9x-pitoisuuteen 50 %:n saannossa. Kun lähtöpitoisuus on noin 10^9–10^10 PFU/ml, näytteet voidaan konsentroida Amicon-konsentraattoreilla noin 4x-pitoisuuksiin 15–30 %:n saannossa ja Vivaspin-konsentraattoreilla 2x-pitoisuuksiin 10 %:n saannossa. Lähtöpitoisuuden ollessa 10^8–10^9 PFU/ml saannot ovat molemmilla konsentraattoreilla <1 %. F50L-roottorin konsentrointitehokkuus on suurempi kuin konsentraattoreilla, ja se on yhtä suuri lähtöpitoisuuksien 8,1·10^10 ja 2,4·10^9 PFU/ml sekä testattujen olosuhteiden kesken: konsentraattien saannot ovat keskimäärin yli 80 % ja loppupitoisuudet noin 5,2x lähtöpitoisuuksiin nähden. F50L-roottorilla olosuhde 15 min, 35 000 rpm riittää Ф6-näytteiden konsentrointiin. Jos laboratoriossa voidaan käyttää ultrasentrifugilaitteistoja, F50L-roottori on konsentraattoreita kustannustehokkaampi näytteiden konsentroinnissa.