Eturauhassyöpä ja seriiniproteaasi trypsiini 2 : RNAi-menetelmän optimointi trypsiini 2 -proteaasia koodaavan PRSS2-geenin vaimentamiseen

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Hannu Koistisen tutkimusryhmässä, Kliinisen kemian laitoksella, Haartman-instituutissa, jossa työtä ohjasi vanhempana tutkijana ryhmässä toimiva Kati Räsänen.

Opinnäytetyössä RNA-interferenssi (RNAi) -menetelmälle pyrittiin löytämään optimaaliset olosuhteet trypsiini 2 -proteaasia koodaavan PRSS2-geenialueen ekspression vaimentamiseksi kolmessa eri eturauhassyöpäsolulinjassa. RNAi:n avulla voidaan vaimentaa tietyn geenin ilmeneminen eliön ilmiasussa.

Eturauhassyöpä, jonka hoidon kehittämiseen opinnäytetyössä keskitytään, on useiden vuosien ajan ollut suomalaisten miesten yleisin syöpäsairaus. Proteaasit, joita työssä tarkastellaan, tuhoavat solujen kalvoja ja aiheuttavat tuhoa ympäröiviin kudoksiin raivaten tilaa jatkuvasti lisääntyvälle syöpäsolukolle. Eturauhanen tuottaa useita eri proteaaseja, joilla tiedetään olevan osuutta syövän kehittymisessä ja joiden ilmentyminen vaihtelee eturauhassyövän eri kehitysasteissa. Trypsiineillä on todettu olevan yhteys useisiin eri syöpätyyppeihin, joten niiden tutkiminen on perusteltua myös eturauhassyövän yhteydessä.

Opinnäytetyön kokeellisessa osuudessa syöpäsolulinjat PC-3, PC-3M ja ALVA-31 viljeltiin kuusikuoppalevyille, jossa niille suoritettiin siRNA-transfektio kolmella eri PRSS2-geenialueen oligonukleotidisekvenssillä. Transfektion jälkeen soluista eristettiin niiden RNA:t, jotka käännettiin käänteiskopioijaentsyymin avulla komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA). cDNA-synteesin jälkeen haluttuja geenituotteita monistettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä (qRT-PCR). qRT-PCR:ssä käytettiin kolmen eri geenialueen (PRSS1, PRSS2, PRSS3) lisäksi GAPDH ja HPRT1 -referenssigeenejä tuloksen normalisointiin.

RNAi-menetelmän optimoinnin lisäksi opinnäytetyö sisältää tutkimukseen käytettyjen eturauhassyöpäsolulinjojen karakterisointia, kasvattamalla niitä hiiressä kasvavasta Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarkoomasta uutetulle keinotekoiselle soluväliaineelle, matrigeelille. Syöpäsolulinjojen solujen migraatiota ja invaasiota seurattiin vuorokauden välein.

This thesis was carried out for Hannu Koistinen's research group, Department of Clinical Chemistry, Haartman Institute, where the work was directed by senior research scientist Kati Räsänen.

The purpose of this thesis was to optimize the conditions of RNA interference (RNAi) method for silencing expression of trypsin-2 protease coding PRSS2 gene sequence in three different prostate cancer cell lines. The overall aim of the RNAi-induced PRSS2 gene silencing was to suppress the migratory phenotype of the prostate cancer cells.

Prostate cancer, whereby the development of treatment this thesis was focused on, has for many years been the most common type of cancer among Finnish men. Proteases, which are focused in this work, destroy cell membranes and cause the destruction of the surrounding tissues. The prostate gland produces several different proteases, which are known to play a role in the development of cancer and which expression varies at different developmental stages. Deregulated trypsin expression has been linked to a number of different types of cancer, including prostate cancer.

In the experimental part of this study the cancer cell lines PC-3, PC-3M and ALVA-31 were cultured in 6-well plates. Cells were allowed to attach overnight, after which the siRNA transfection was performed using three different PRSS2 oligonucleotide sequences. After transfection, RNA was isolated and then translated by reverse transcriptase (RT) to complementary DNA (cDNA). After the cDNA synthesis, the desired gene products were amplified by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). The relative expression of the following genes was analyzed by qRT-PCR: PRSS1, PRSS2 and PRSS3. Housekeeping genes HPRT1 and GAPDH were used to normalize the results.

In addition of the optimization of the RNAi-method, this thesis includes morphological characterization of the used prostate cancer cell lines. Cells were cultured in three-dimensional Matrigel, which is extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma grown in mouse. It is artificial but emulates natural extracellular matrix. Cell migration and invasion was monitored daily during the growth in the Matrigel.