Site-directed mutagenesis and purification of TmPPase protein for structural analyses
Bochkov, Sakari (2024)
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2024112429644
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2024112429644
Tiivistelmä
Työ toteutettiin Helsingin yliopiston rakenteellisen biologian tutkimusryhmälle, jota johtaa professori Adrian Goldman. Ryhmän tutkimus on osa monikansallista yhteistyötä, johon kuuluu useita tutkimusryhmiä, ja sen tavoitteena on kehittää potentiaalisia lääkkeitä sairauksiin, kuten malariaan, toksoplasmoosiin ja leishmanioosiin.
Plasmodium- ja Leishmania-suvun alkueläimet aiheuttavat vakavia sairauksia. Pelkästään malaria oli vastuussa 608 000 kuolemasta vuonna 2022. Nämä loiset käyttävät membraani-pyrofosfataaseja (M-PPaasi) selviytyäkseen osmoottisen paineen muutoksista siirtyessään isäntäeläimeen ja sieltä pois. Näitä entsyymejä ei kuitenkaan esiinny ihmisissä, joten niitä pidetään mahdollisina kohteina inhibitiolle.
Tämä projekti on jatkoa viimeaikaiselle tutkimukselle, jonka tavoitteena on selvittää inhiboivien yhdisteiden vaikutuksia Thermotoga maritima -bakteerista peräisin olevaan vastaavaan M-PPaasi-proteiiniin (TmPPaasi) käyttäen kaksoiselektroni-elektroniresonanssi (DEER) -menetelmää. Tämä menetelmä mahdollistaa kysteiiniaminohappotähden välisen etäisyyden määrittämisen, ja aminohappotähtiä voidaan mutatoida kysteiiniksi strategisissa paikoissa proteiinin aktiivisuuden aikana tapahtuviin heliksien liikkeisiin liittyvien tietojen saamiseksi.
Tässä työssä TmPPaasi-geeni, joka oli aiemmin mutatoitu kohdassa 211, mutatoitiin myös kohdassa 525, ilmennettiin hiivan kalvossa ja puhdistettiin aktiivisuusanalyysejä varten. Aktiivisuusmittaustulokset osoittivat, että kaksoismutaatio inaktivoi entsyymin täysin, tehden mutaatioista sopimattomia DEER-tutkimuksiin.
Plasmodium- ja Leishmania-suvun alkueläimet aiheuttavat vakavia sairauksia. Pelkästään malaria oli vastuussa 608 000 kuolemasta vuonna 2022. Nämä loiset käyttävät membraani-pyrofosfataaseja (M-PPaasi) selviytyäkseen osmoottisen paineen muutoksista siirtyessään isäntäeläimeen ja sieltä pois. Näitä entsyymejä ei kuitenkaan esiinny ihmisissä, joten niitä pidetään mahdollisina kohteina inhibitiolle.
Tämä projekti on jatkoa viimeaikaiselle tutkimukselle, jonka tavoitteena on selvittää inhiboivien yhdisteiden vaikutuksia Thermotoga maritima -bakteerista peräisin olevaan vastaavaan M-PPaasi-proteiiniin (TmPPaasi) käyttäen kaksoiselektroni-elektroniresonanssi (DEER) -menetelmää. Tämä menetelmä mahdollistaa kysteiiniaminohappotähden välisen etäisyyden määrittämisen, ja aminohappotähtiä voidaan mutatoida kysteiiniksi strategisissa paikoissa proteiinin aktiivisuuden aikana tapahtuviin heliksien liikkeisiin liittyvien tietojen saamiseksi.
Tässä työssä TmPPaasi-geeni, joka oli aiemmin mutatoitu kohdassa 211, mutatoitiin myös kohdassa 525, ilmennettiin hiivan kalvossa ja puhdistettiin aktiivisuusanalyysejä varten. Aktiivisuusmittaustulokset osoittivat, että kaksoismutaatio inaktivoi entsyymin täysin, tehden mutaatioista sopimattomia DEER-tutkimuksiin.