Genotyypitysmenetelmän pystyttäminen hepatiitti E -virukselle

Abstract

Opinnäytetyö toteutettiin yhteistyössä Helsingin yliopiston elintarvike- ja ympäristövirologian tutkimusryhmän kanssa. Työn tavoitteena oli pystyttää menetelmä suomalaisilla sikatiloilla esiintyvän hepatiitti E -viruksen genotyypin ja alatyypin määritykseen. Hepatiitti E -viruksen genotyypit HEV-3 ja HEV-4 ovat zoonoottisia, ja erityisesti siat ovat merkittäviä HEV-kantajia. Tämä on merkittävää, koska zoonoosivirukset voivat tarttua ihmisiin kontaktista eläinten kanssa ja elintarvikkeiden kautta. Alatyyppiluokitus on tärkeä viruksen leviämisen ja epidemiologian ymmärtämisen sekä tarkemman diagnosoinnin, hoidon suunnittelun ja rokotteiden kehittämisen kannalta.

HEV:n suhteen tuntemattomasta 28 näytteestä eristettiin RNA:ta, minkä jälkeen näytteille tehtiin inhibiittorienpoistokäsittely. Neljä näytettä todettiin HEV:n suhteen positiiviseksi RT-qPCR-esianalyysissä ja vahvimmat HEV-positiiviset näytteet valittiin sisäkkäiseen PCR:ään Ct-arvojen perusteella. PCR-tuotteet analysoitiin geelielektroforeesilla ja lähetettiin sekvensoitavaksi Helsingin yliopiston DNA Sequencing and Genomics Laboratory (BIDGEN) -yksikköön.

Geelielektroforeesilla analysoidut PCR-tuotteet vastasivat odotettua 565 emäsparin pituutta sekä positiivista kontrollia. Sanger-sekvensointi vahvisti hepatiitti E -viruksen genotyypin sekä alatyypin. Menetelmä saatiin onnistuneesti pystytettyä.

The thesis work was carried out in collaboration with the Food and Environmental Virology Research Group of the University of Helsinki. The aim of the thesis work was to establish a method for determining the genotype and subtype of hepatitis E virus occurring in Finnish pig farms. Hepatitis E virus genotypes HEV-3 and HEV-4 are zoonotic, and pigs are significant carriers of HEV. Zoonotic viruses are noteworthy due to their ability to transmit to humans through animal contact and food sources. Subtyping plays a significant role in understanding the transmission and epidemiology of the virus, and it contributes to more precise diagnostics, treatment strategies, and vaccine development.

For the study, RNA was extracted from 28 samples that had an unknown HEV status, afterwards the samples underwent inhibitor removal treatment. Four samples tested positive for HEV in the preliminary RT-qPCR analysis. Based on the Ct values, the strongest HEV-positive samples were selected to nested PCR analysis. The PCR products were analysed by gel electrophoresis and sent for sequencing to the DNA Sequencing and Genomics Laboratory (BIDGEN) unit of the University of Helsinki.

The PCR products, as determined by gel electrophoresis, corresponded to the expected length of 565 bp and the positive control. Sanger sequencing confirmed the genotype and subtype of the hepatitis E virus. The method was successfully established.