Siirtogeenisten Arabidosis-kasvien morfologinen ja molekulaarinen kuvaileminen

Abstract

Opinnäytetyö oli osa Helsingin Yliopiston Maataloustieteiden laitoksen tutkimusprojektia, jossa tutkitaan, kuinka FUPS-signaalit vaikuttavat kukan kehittymiseen. Työn tavoitteena oli seuloa T-DNA insertiomutanttilinjoja ja etsiä niistä homotsykoottiset mutaatiot ja ottaa käyttöön sekä standardoida infektointimenetelmä, jolla on mahdollisuus tutkia mutatoitujen E3-entsyymien vaikutuksia kasvien vasteisiin.

Siirtogeenisten Aradidopsis thalianan siemenet kerättiin ja istutettiin steriilisti kanamysiiniä tai basta-herbisidiä sisältävälle selektiiviselle kasvatusmaljalle. Kasvien selviytymisprosentti laskettiin viikon itämisen jälkeen, jolloin saatiin alustavat tulokset T-DNA insertion homotsykoottisuudesta. DNA-eristys tehtiin isopropanolisaostuksella kahden viikon vanhoista kasvien lehdistä. DNA:lle tehtiin PCR-monistus, jolla tarkastettiin jo aiemmin tehdyn T-DNA insertion monistumis-tulokset. Lopullinen tulos saatiin tekemällä PCR-tuotteelle geelielektroforeesi. Infektointimenetelmän käyttöönotossa ja menetelmän standardoimisessa käytettiin Columbia-0 -kasvia, joka infektoitiin kastamalla se Botrytis cinerea-sienen itiöitä sisältävään suspensioon.

Työssä käytiin läpi 41 mutanttilinjakandidaatti kasvilinjaa, joissa oli kahta erilaista T-DNA linjaa, joista toinen oli kanamysiiniresistentti ja toinen basta-herbisidiresistentti. Näistä kanamysiiniresistenttejä linjoja oli kuusi ja basta-herbisidiresistenttejä linjoja oli neljä. Insertiot olivat kahdeksassa eri geenissä. Näistä kymmenestä linjasta T-DNA inserttio homotsygoottisena löytyi kuudesta, kaksi ohitettiin, yhden linjan tuloksena oli villityyppi ja yhdestä linjasta mutaatio löytyi heterotsykoottisena ja villityyppinä. Tavoitteena olleet infektointimenetelmän standardointi ja RNA-näytteiden kerääminen onnistuivat. Infektoinnissa hyödyllisimmäksi suspensioksi osoittautui vahvin konsentraatio. Tutkimusryhmälle jäi Infektointimenetelmästä saatujen RNA-näytteiden analysointi ja niiden tulosten standardointi menetelmään.

The study was a part of the project of the Department of Agricultural Sciences of the University of Helsinki that studied how FUPS-signals affect flower development. The aims of the study were to screen of the T-DNA mutant plant lines and to find homozygous mutants of them and to introduce and to standardize an infection method with the opportunity to research the mutant E3 enzyme’s effect on flower responses.

Seeds of the transgenic Arabidopsis plants were collected and planted in sterile Kanamycin or Basta herbicide containing the selective media. The plant survival was calculated a week after germination, and then a DNA extraction was done by isopropanol precipitation on leaves of the plants that were two weeks old. The DNA was subjected to PCR amplification, which inspected the results of the previously done T-DNA insertion. The final results were obtained by making a gel electrophoresis to the PCR product. Columbia-0 plant was used to introduce and standardize an infection method by dipping the plant into a suspension containing spores of the Botrytis cinerea fungus.

The 41 mutant plant lines that were examined had two kinds of T-DNA insertion lines: six lines were kanamycin resistant and four lines were basta-herbicide resistant. These T-DNA insertions were placed in eight genes. Of these ten lines the T-DNA insertion was found as homozygous in six lines, two lines were skipped, one line was a wild type, and in one line the mutation was both heterozygous and a wild type. One of the aims of this study was standardize the infect method for plants. The most useful suspension to make the infection was the concentration of 106. The further task of the group will be to analyze the RNA samples and standardize them to the infection method.