Optimization of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Format Utilizing SpyTag/SpyCatcher- Interaction To Capture Mammalian Cell-Expressed Protein Antigens

Abstract

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida ELISA (entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys) -formaatti, joka hyödyntää SpyTag/SpyCatcher-vuorovaikutusta nisäkässoluissa tuotettujen rekombinanttiproteiiniantigeenien immobilisoimiseksi. Tämä lähestymistapa tarjoaa vaihtoehdon perinteiselle vasta-ainepohjaiselle immobilisoinnille ja mahdollistaa uusien, puhdistamattomien antigeenien tunnistamisen ilman validoituja vasta-aineita. HEK293T-soluja käytettiin proteiinien ilmentämiseen, ja optimaalinen inkubointiaika määritettiin tarkastelemalla kohdeantigeenin ja kokonaisproteiinin välistä suhdetta.

ELISA-optimoinnissa keskityttiin testaamaan muuttujia mikrolevyjen päällystämisessä SpyCatcherilla sekä epäspesifisten sitoutumiskohtien blokkaamiseen. Kokeissa verrattiin käytettyjä reagensseja ja materiaaleja, inkubointiaikoja ja -lämpötiloja, SpyCatcher-pitoisuuksia sekä antigeenilysaattien laimennussuhteita. Käytettyjen vasta-aineiden spesifisyyttä ja taustasignaalin tasoa arvioitiin, jotta voitiin erottaa analyyttispesifinen signaali epäspesifisestä sitoutumisesta.

Parhaat tulokset saavutettiin, kun kaivot päällystettiin karbonaatti–bikarbonaattipuskurilla, jossa on 2 µg/ml SpyCatcheriä, inkuboimalla levyjä +37 °C:ssa 1,5 tunnin ajan ja blokkaamalla kaivot maitojauheella. Nämä olosuhteet vähensivät taustasignaalia ja paransivat spesifisen signaalin havaitsemista. Kehitetty menetelmä tarjoaa käytännöllisen työkalun patogeeniantigeenien tunnistamiseen ja vasta-ainereaktioiden tutkimiseen erityisesti tilanteissa, joissa validoituja vasta-aineita ei ole saatavilla.

The aim of this thesis was to optimize an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) format that utilizes SpyTag/SpyCatcher interaction to immobilize recombinant protein antigens expressed in mammalian cells. This approach offers an alternative to conventional antibody-based immobilization and enables the use of unpurified recombinant antigens without the need for target-specific capture antibodies. HEK293T cells were employed for protein expression, and optimal incubation time was determined by observing the ratio between target antigen and total protein.

ELISA optimization focused on testing variables for coating microplates with SpyCatcher and blocking nonspecific binding sites. The experiments compared reagents and materials, incubation times and temperatures, SpyCatcher concentrations, and antigen lysate dilution ratios. Antibody specificity and background signal levels were evaluated to distinguish analyte-specific signal from nonspecific signal.

The best results were achieved when wells were coated with 2 µg/mL SpyCatcher in carbonate–bicarbonate buffer at +37 °C for 1.5 hours, followed by blocking with milk powder. These conditions minimized background and enhanced specific signal detection. The developed method provides a practical tool for identifying pathogen antigens and studying antibody responses, particularly in cases where validated antibodies are unavailable.