Lituruohon geenimutaatioiden analysointi juuressa ja niiden vaikutus jälsisolukkoon

Abstract

Opinnäytetyömme tarkoitus oli analysoida lituruohomutanttilinjoja käänteisen genetiikan avulla. Kasvilinjojen analysoiminen perustuu T-DNA-insertion avulla tehtävään mutaatioon, joka estää geenin toiminnan kasvin genomissa. Lituruohon juuren fenotyypistä tehdään johtopäätöksiä vertaamalla muutoksia villi tyypin kasvilinjoihin ja päättelemällä paksuuskasvun muutosten merkitystä jällen toiminnan säätelyssä.

Tutkittavat mutanttilinjat valittiin mikroarray-tutkimuksissa saatujen tulosten perusteella. Analysoimme 47 kandidaattigeenin sisältävää linjaa, joista meidän piti ensin selvittää viiden genotyyppi PCR-menetelmän avulla. Näiden lisäksi käsittelimme yhdeksää crf-mutanttilinjaa ja kahta GUS-promoottorilinjaa.

T-DNA-insertion sisältämät siemenlinjat tilattiin kantakeskuksesta ja niitä kasvatettiin kaksi viikkoa kasvatusmaljoilla. Homotsygoottien kasvilinjojen juuria analysoitiin histologisten poikkileikkeiden avulla, mittaamalla juurten paksuus 0,5 cm hypokotyylialueen alapuolelta. Poikkileikkeitä vertailtiin villi tyypin kontrolliin (Columbia) mahdollisten jälsisolukkoon vaikuttavien fenotyyppien löytämiseksi lituruohon juuressa.

Keskeisinä tuloksina löysimme yhteensä 8 tilastollisesti merkittävää linjaa, joissa voisi esiintyä mahdollinen fenotyyppi paksuuskasvun suhteen. Näiden lisäksi olemme tarkastelleet muutamaa muuta fenotyypin suhteen kiinnostavaa linjaa. Suurin ero Columbian ja mutanttilinjan (L1) välillä oli -166,6 μm, joka vastasi 70,1 % villi tyypin halkaisijasta. Analyysi toteutettiin kuitenkin vain kerran ja pienellä otoksella. Tästä huolimatta tulosten avulla pystytään karsimaan potentiaalisten mutanttilinjojen määrää, joissa geeneillä olisi vaikutusta jällen aktiivisuuden säätelyssä.

The purpose of this study was to analyze the root of Arabidopsis thaliana mutant lines using reverse genetic analysis. With reverse genetics we can study the effects of a single missing gene by observing its effect on the plant phenotype. The studied mutant lines were made using agrobacteria mediated T-DNA insertion techniques.

We analyzed mutant lines searching for genes that would affect cambium development and activity. The mutant lines for our study were chosen based on results from an earlier microarray study. In our study we had 47 candidate genes, 5 of which needed to be genotyped before analysis. We also had 9 crf-mutant lines available for analysis, and 2 GUS-promoter lines for CRF-genes.

We planted seeds acquired from stock centers and grew them for two weeks. We analyzed the plants by conducting histological crosscuts and measuring the thickness of the roots at 0,5 centimeters below the hypocotyl. These figures were then compared with our wild type control (Columbia) in order to find a possible phenotype that could indicate a change in cambium development and activity in the Arabidopsis root.

Results based on the comparison of root diameter to the Columbia control showed that 8 out of 56 candidate mutant lines were statistically significant concerning a possible phenotype. In addition, we found a number of other interesting phenotypes, which we have examined more closely. The largest average difference between Columbia and a candidate mutant line (L1) was -166,6 μm (a root diameter of 70,1% of the Columbia root). However this study was performed with only one biological repeat and a small sample collection. In conclusion, this study will help narrow down the search for cambium mutant genes, and serve as a stepping stone for further research into the most promising mutant lines.