Herpes simplex viruksen kvantitatiivisen määrityksen optimointi reaaliaikaiselle PCR -laitteelle : työohje bioanalyytikko-opiskelijoille
Heinonen, Henry (2015)
Heinonen, Henry
Savonia-ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201505107188
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201505107188
Tiivistelmä
Reaaliaikaisella PCR -laitteella monistetaan entsymaattisesti haluttua DNA -aluetta. Reaktion etenemistä voidaan seurata reaaliajassa laitteen avulla reaktion lähettämän fluoresenssisignaalin kautta, joka lisääntyy, kun DNA -kopioita syntyy. Opinnäytetyön sovellus on virusdiagnostinen, jossa Herpes simplex virus 1:n määrää määritetään. Herpes -virukset ovat yleisiä viruksia, jotka aiheuttavat yskänrokkoa, suutulehdusta, genitaalialueen tulehdusta ja pahimmillaan herpes-enkefaliittia.
PCR:ssa on monia tekijöitä, mitä voidaan optimoinnin avulla muuttaa haluttuun suuntaan, jotta reaktio tulisi tehokkaammaksi. Reaktiosta voidaan muuttaa reagenssien pitoisuuksia, reaktiovaiheiden aikoja ja lämpötiloja. Tässä opinnäytetyössä optimointi keskittyi PCR:n annealing -vaiheen lämpötilaan, joka saatiin optimoitua lämpötilagradienttiajolla. Optimaaliseksi reaktiolämpötilaksi saatiin 56 OC.
Kvantitatiivinen PCR perustuu näytteenä olevan DNA:n määrittämiseen, jossa standardien avulla muodostetaan standardisuora, kun standardien pitoisuus tunnetaan. Kvantitatiivisessa PCR:ssä on oleellista Ct -arvot (Threshold cycle), jotka muodostuvat reaktiokäyrän ylittäessä kynnystason reaaliaikaisessa PCR:ssä. Käyrän Ct -arvo on suoraan verrannollinen DNA -kopioiden alkuperäiseen määrään. Tässä opinnäytetyössä käytettiin standardeina plasmidiliuoslaimennoksia, joiden pitoisuus oli mitattu. Ct -arvojen ja pitoisuuksien kautta muodostetun suoran avulla pystyttiin määrittämään viruskantaliuoksen pitoisuus.
Toiminnallisen opinnäytetyön tavoitteena on kehittää Savonia-ammattikorkeakoulun bioanalytiikan koulutusohjelman sisältöä ottamalla käyttöön uusi Rochen LightCycler 96 reaaliaikainen PCR -laite. Tarkoituksena oli tehdä työohjeet PCR -sovellukseen, joka tulisi osaksi molekyylibiologian ja geeniteknologian kurssin harjoitustunteja. Työohjeissa keskityttiin materiaalin opettavuuteen, jossa opiskelija itse suunnittelee toimintaa ohjatusti ja pohtii toimintaansa kysymyksien avulla.
PCR:ssa on monia tekijöitä, mitä voidaan optimoinnin avulla muuttaa haluttuun suuntaan, jotta reaktio tulisi tehokkaammaksi. Reaktiosta voidaan muuttaa reagenssien pitoisuuksia, reaktiovaiheiden aikoja ja lämpötiloja. Tässä opinnäytetyössä optimointi keskittyi PCR:n annealing -vaiheen lämpötilaan, joka saatiin optimoitua lämpötilagradienttiajolla. Optimaaliseksi reaktiolämpötilaksi saatiin 56 OC.
Kvantitatiivinen PCR perustuu näytteenä olevan DNA:n määrittämiseen, jossa standardien avulla muodostetaan standardisuora, kun standardien pitoisuus tunnetaan. Kvantitatiivisessa PCR:ssä on oleellista Ct -arvot (Threshold cycle), jotka muodostuvat reaktiokäyrän ylittäessä kynnystason reaaliaikaisessa PCR:ssä. Käyrän Ct -arvo on suoraan verrannollinen DNA -kopioiden alkuperäiseen määrään. Tässä opinnäytetyössä käytettiin standardeina plasmidiliuoslaimennoksia, joiden pitoisuus oli mitattu. Ct -arvojen ja pitoisuuksien kautta muodostetun suoran avulla pystyttiin määrittämään viruskantaliuoksen pitoisuus.
Toiminnallisen opinnäytetyön tavoitteena on kehittää Savonia-ammattikorkeakoulun bioanalytiikan koulutusohjelman sisältöä ottamalla käyttöön uusi Rochen LightCycler 96 reaaliaikainen PCR -laite. Tarkoituksena oli tehdä työohjeet PCR -sovellukseen, joka tulisi osaksi molekyylibiologian ja geeniteknologian kurssin harjoitustunteja. Työohjeissa keskityttiin materiaalin opettavuuteen, jossa opiskelija itse suunnittelee toimintaa ohjatusti ja pohtii toimintaansa kysymyksien avulla.