Uuden nukleiinihappoeristykseen pohjautuvan näytteenkäsittelymenetelmän kehittäminen rotavirukselle

Abstract

Rotavirus on kaksijuosteinen RNA-virus, joka aiheuttaa korkeakuumeisen suolistoinfektion. Taudinkuvaan liittyy myös voimakasta oksentelua ja vesiripulia. Rotavirusinfektiot ovat tyypillisiä pienillä lapsilla, yleisimmillään ne ovat 6-24 kuukauden ikäisillä. Rotaviruksesta tunnetaan useita eri serotyyppejä, jotka luokitellaan A-G luokkiin. Näistä A, B ja C voivat aiheuttaa taudin ihmisessä.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää Orion Diagnostican uutta nukleiinihappoeristykseen perustuvaa näytteenkäsittelymenetelmää rotavirukselle. Menetelmä perustuu magneettisten silikananopartikkelien käyttöön ja siinä on neljä eri vaihetta: lyysaus, kaksi pesuvaihetta ja eristetyn nukleiinihapon eluointi.

Rotaviruksen diagnosointiin ulosteesta käytetään nykyisin esimerkiksi antigeenipohjaisia pikatestejä ja PCR-menetelmää. Kehitettävän menetelmän tarkoitus on helpottaa RNA-eristystä. Tutkittavan menetelmän avulla suoritettua nukleiinihapon eristystä todennetaan käyttämällä RT-qPCR-menetelmää sekä vertaamalla saatuja tuloksia kaupalliseen mag-neettipartikkelipohjaiseen eristysmenetelmään.

Työn aikana suoritettujen tutkimusten pohjalta eristysmenetelmän lyysausvaihetta optimoitiin tehoamaan rotaviruksen kolmikerroksiseen kapsidiin. Tätä varten kehitettiin uusi puskuri ja sen toimintaa tehostettiin vielä inkuboimalla näytettä korkeassa lämpötilassa. Tämän avulla RNA saatiin vapautumaan lyysausliuokseen tehokkaammin.

Saatujen tulosten perusteella voidaan todeta, että kehitettävällä menetelmällä päästään samoihin ellei suurempiin RNA-saantoihin, kuin kaupallisella vertailumenetelmällä näytteen sisältäessä vain rotaviruspartikkeleja. Toisaalta tutkimuksissa todettiin ulostenäytemateriaalin häiritsevän RNA-eristystä merkittävästi.

Tulosten perusteella menetelmä tarvitsee vielä jatkotutkimuksia niin lyysauksen tehostamisen, kuin ulosteen RNA-eristykseen aiheuttaman inhibition vuoksi. Myös magneettisten silikananopartikkelien RNA:n sitomiskykyyn tulisi perehtyä tarkemmin.

Rotavirus is a double stranded RNA virus, which causes gastroenteritis with high fever. Symptoms include severe vomiting and diarrhea. Rotavirus infections are typical in young children; most frequent they are with children aged between 6-24 months. Rotaviruses can be classified for several serotypes, namely from A to G. Serotypes A, B and C can infect humans.

The aim of this thesis was to develop a new nucleic acid isolation based sample preparation method for rotavirus. The thesis was conducted at Orion Diagnostica. The method is based on the use of magnetic silica nanoparticles, and it includes four steps: lysis, two washing steps and elution of isolated nucleic acid. In order to diagnose rotavirus in stool, antigen-based rapid tests and RT methods are currently used.

The new method was developed to facilitate the RNA isolation. The new RNA extraction method was verified with RT-qPCR-method and the results were compared with a commercial extraction method, based on magnetic particles.

During the thesis project, the lysis step of the extraction method was optimized to be more effective for the three-layered capsid of rotavirus. For this purpose, a new buffer was developed and the activity was enhanced by incubating the sample at high temperature. This lead to a more efficient lysis and a better RNA extraction result.

On the basis of the results, it can be concluded that with by new method, similar RNA yields could be achieved as by the commercial reference method when the sample contains suspended rotavirus particles. However, the fecal sample material significantly inhibited the RNA extraction.

According to the results, the method needs further investigation regarding lysis efficiency and the effect of fecal material on the RNA extraction method. Also the RNA binding capacity of magnetic nanoparticles should be studied more.