Uuden nukleiinihappoeristykseen pohjautuvan näytteenkäsittelymenetelmän kehittäminen rinovirukselle

Abstract

Rinovirukset ovat yleisimpiä ympärivuotisia lievien hengitystieinfektioiden aiheuttajia. Rinovirusten aiheuttamiin hengitystiesairauksiin liittyvät lääkärikäynnit ja sairauspoissaolot ovat suuri ekonominen taakka yhteiskunnalle. Kliinisten näytteiden diagnostiikkaan käytetään herkkää ja luotettavaa PCR-testiä, eikä rinovirusten diagnostiikkaan ole tällä hetkellä käytössä vieritestiratkaisuja. Jotta kliinisistä näytteistä voidaan testata mahdollisen virusgenomin läsnäolo, on niistä ensin eristettävä RNA jollakin nukleiinihappojen puhdistusmenetelmällä.

Tämän insinöörityön kokeellinen osuus toteutettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa. Työn tavoitteena oli pystyttää yrityksessä kehitetty uusi näytteenkäsittelymenetelmä rinovirukselle. Kehitettävä näytteenkäsittelymenetelmä pohjautuu paramagneettisten silikananopartikkeleiden käyttöön nukleiinihappojen puhdistuksessa. Näytteenkäsittelymenetelmä oli tarkoitus optimoida mahdollisimman tehokkaaksi RNA-saannon suhteen sekä yhteensopivaksi Orion Diagnostica Oy:n isotermaalisen geenimonistusmenetelmän, SIBA®:n (Strand Invasion Based Amplification), kanssa.

Näytteenkäsittelymenetelmän kehittämiseen käytettiin pääasiallisena tutkimustyökaluna kvantitatiivista käänteiskopiointi-PCR-protokollaa. Näytteenkäsittelymenetelmän parametreja optimoitiin siten, että eristyksen RNA-saanto oli kvantitatiivisten tulosten perusteella konsentraatioltaan mahdollisimman suuri. Lopuksi kehitettävän näytteenkäsittelymenetelmän RNA-saantoa verrattiin vertailumenetelmällä saavutettuun RNA-saantoon vastaavasta rinoviruspartikkelimäärästä.

RNA:n puhdistaminen rinoviruspartikkeleista onnistui kehitettävällä menetelmällä hyvin: vertailumenetelmän tehokkuudesta jäätiin parhaimmillaan vain 9,4 % jälkeen. Menetelmän todellista tehokkuutta RNA-saannon suhteen ei kuitenkaan voitu määrittää, sillä käytettävissä ei ollut kliinisiä rinoviruspositiivisia näytteitä tai kliinistä virusmäärää vastaavaa tunnettua viruspartikkelipitoisuutta. Jatkossa näytteenkäsittelymenetelmää kehitettäessä on kiinnitettävä huomiota etenkin sen soveltuvuuteen käytettäväksi oikean näytematriisin sekä SIBA®-teknologian ja kylmäkuivattujen reagenssien kanssa.

Human rhinoviruses are the most common cause of respiratory tract infections throughout the year. Medical visits and missed days at work due to respiratory illnesses caused by rhinoviruses are economic burdens for society. Rhinoviruses in clinical respiratory samples are commonly detected by a sensitive and reliable PCR test. Currently there are no point-of-care tests available for the diagnosis of human rhinoviruses. In order to detect possible presence of rhinovirus, the RNA has to be first extracted from clinical samples by a nucleic acid purification method.

The experimental part of this thesis was executed in the research and development laboratory of Orion Diagnostica Oy. The aim was to set up a novel sample preparation method for rhinovirus, previously developed within the company. The sample preparation method is based on the use of paramagnetic silica coated nanoparticles in nucleic acid purification. The goal was to optimize the method regarding the extracted RNA yield and compatibility with the Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) – an isothermal gene amplification technology owned by Orion Diagnostica Oy.

A quantitative reverse transcription polymerase chain reaction protocol was used as a tool to measure the functionality of the sample preparation method. Parameters of the sample preparation method were optimized to achieve a maximal RNA yield and level of purification. Finally, the RNA yield of the developed method was compared to that of a reference method from the same virion count.

RNA purification of rhinovirus particles using the developed method was successful: at its best the method missed only 9.4 percentages of the efficiency rate of the reference method. The efficiency rate for clinical samples could not yet be determined due to lack of samples or a known viral load. In the future, the sample preparation method should be developed further together with actual sample matrix, SIBA® technology and freeze-dried reagents for SIBA reaction.