Development, production and characterisation of novel triiodothyronine (T3) -specific recombinant antibodies

Abstract

This Bachelor’s thesis was carried out at VTT Technical Research Centre of Finland. The purpose of the thesis was the development, production and characterisation of novel 3,3,5-triiodo-L-thyronine (T3) –specific recombinant antibodies.

A semi-automated selection method called biopanning was applied to the in vitro development of the novel antibodies from the previously constructed and validated phage displayed recombinant antibody (Fab) library. The Fab library, constructed from an immunised source, has been successfully panned against T3 before, with an outcome of multiple novel anti-T3 Fabs (Henri Arola 2011). Here two different selection strategies were studied in order to optimize the amount of novel antibodies for T3 thyroid hormone.

After selections, 768 individual recombinant antibody clones were produced in E.coli bacteria cells and their binding activities against T3 were assayed from the culture supernatants by ELISA with the robotic workstation. Number of the screened clones was reduced by affinity and specificity rankings with ELISAs. The heavy and light chains of the twenty most interesting clones were sequenced. Finally, three anti-T3 clones with different binding characteristics were selected for a small-scale production, purification and the further characterisations.

As a result, one T3-specific and one high-affinity multi-specific clone were obtained. These antibodies together with the previously developed anti-T3 antibodies provide valuable information regarding to the amino acid sequences responsible for the molecular recognition of the T3 thyroid hormone.

Opinnäytetyö tehtiin valtion teknillisessa tutkimuskeskuksessa (VTT) bioanalytiikan tutkimusryhmässä. Työn tarkoituksena oli uusien kilpirauhashormoni (3,3,5-trijodityroniini, T3) –spesifisten rekombinanttivasta-aineiden kehittäminen, tuottaminen ja tutkiminen.

Vasta-aineita eristettiin in vitro aiemmin tehdystä ja validoidusta vasta-ainekirjastosta faaginäyttötekniikan avulla. Työssä käytettyä vasta-ainekirjastoa on aiemmin käytetty onnistuneesti T3-spesifisten vasta-aineiden eristykseen (Henri Arola 2011). Tässä työssä käytettiin kahta eri valintamenetelmää parantamaan eristettävien T3-spesifisten vasta-aineiden saantoa.

Eristyksen jälkeen 768 yksittäistä rekombinanttivasta-ainekloonia tuotettiin E.coli bakteerissa. Vasta-ainekloonien T3-aktiivisuutta arvioitiin ELISA-testeillä, jotka toteutettiin robottiaseman avulla. Tutkittavien kloonien määrää vähennettiin arvioimalla kloonien aktiivisuutta ja spesifisyyttä T3:a kohtaan erilaisilla ELISA-testeillä. Jäljelle jääneiden kahdenkymmenen kiinnostavimman kloonin kevyiden ja raskaiden ketjujen aminohappojärjestykset määritettiin. Lopulta kolme sitoutumisominaisuuksiltaan ja aminohappojärjestykseltään erilaista anti-T3-kloonia valittiin pienen mittakaavan tuottoon. Tuotetut vasta-aineet puhdistettiin, jonka jälkeen niiden sitomisominaisuuksia määritettiin tarkemmin ELISA-testien avulla.

Tuloksena saatiin yksi T3-spesifinen ja yksi korkea-affiniteettinen moni-spesifinen anti-T3 klooni. Yhdessä aiemmin eristettyjen kloonien kanssa työ tuotti arvokasta tietoa T3 kilpirauhashormonin tunnistamisesta vastaavista aminohapposekvensseistä.