Development of a Specific Cell-based Platform to Analyze Proteolytic Activity of Cancer Relevant Serine Proteases

Abstract

Serine proteases modify the cell's internal and external environment, whereas their most important role is in activating or inactivating other proteins by cleavage and their dysregulation is one feature of cancer. They are particularly implicated in tumor growth, invasion and metastasis. Serine proteases are associated with diverse cancer types and pathologies, such as ovarian and prostatic cancer, but also inflammatory and viral diseases. Serine proteases are widely studied as biomarkers and drug targets in drug discovery although compounds with good pharmacokinetic properties have been difficult to obtain.

The aim of this thesis was to develop an enzymatic assay targeting hepsin, which is associated inter alia with breast cancer. The development project was made for the Cancer Cell Circuitry Laboratory that is investigating oncogenes and tumor suppressors in breast cancer. The Cancer Cell Circuitry Laboratory is part of the Translational Cancer Research Program in Institute of Biomedicine in University of Helsinki. The development project consisted of two assay formats, namely biochemical assay and cell-based assay. The bio-chemical assay was optimazed and further developed from a commercial protocol based on recombinant hepsin by R&DSystems. The development of cell-based assay was based on doxycycline inducible hepsin expressed in non-malignant mammary epithelial MCF 10A cells.

Final assay design parameters includes 0.1 nM rhHepsin, 15 µM BOC, 6 µM positive control and 0.3 % DMSO. The functionality of the biochemical assay was verified by signal variability assessment and further ascertained by the compound screening. It should be noted that the compounds are exposed to changes in room temperature during incubation which leads to significant variations in results regarding compounds.

The development of the cell-based assay could not be finalized due to the extent of the project and lack of time caused by replacement of the original equipment. Since the time scope was too limited for a thorough experimental design, all results can be considered indicative. The vital point is to ensure cell viability after seeding to 96-well plate as it is the main source of variation. Another aspect is the usage of doxycyclin which may lead to a combined reaction with the substrate.

Seriiniproteaasit muokkaavat solun ulkoista ja sisäistä ympäristöä, missä niiden tärkein rooli on muiden proteiinien pilkkominen aktiivisiksi tai inaktiivisiksi, ja niiden säätelyhäiriö on yksi syövän tunnusmerkeistä. Erityisesti ne osallistuvat tuumorin kasvuun, invaasioon ja etäpesäkkeiden leviämiseen. Seriiniproteaasit on liitetty erilaisiin syövän lajeihin ja sairauksiin, kuten munasarjojen ja eturauhasen syöpiin, mutta myös tulehdus- ja virustauteihin. Seriiniproteaaseja on laajalti tutkittu lääkekehityksen kohteina, vaikka hyvien farmakokineettisten ominaisuuksien omaavia yhdisteitä on ollut vaikea löytää.

Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää entsymaattinen määritysalusta, jonka kohteena on hepsin, joka liittyy muun muassa rintasyöpään. Kehittämishanke tehtiin Cancer Cell Circuitry laboratoriolle, joka tutkii rintasyöpään liittyviä onkogeenejä ja tuumorisuppressoreita. Cancer Cell Circuitry laboratorio on osa Biomedicumin Biolääketieteen laitoksen Translationaaalisen syöpätutkimuksen ohjelmaa. Kehittämishanke koostui kahdesta formaatista eli biokemiallisesta määritysalustasta ja solupohjaisesta määritysalustasta. Biokemiallinen määritysalusta optimointiin ja edelleen kehitettiin kaupallisesta protokollasta, joka perustui R&DSystemsin rekombinanttiin hepsiniin. Solupohjaisen määritysalustan kehittämisen perustana käytettiin hyvänlaatuista MCF 10A rintaepiteelisolulinjaa, jossa hepsiinin ekspressio indusoitiin doksysykliinillä.

Valmis biokemiallinen määritysalusta pitää sisällään 0.1 nM rhHepsiiniä, 15 µM BOC substraattia, 6 µM positiivista kontrollia ja 0.3 % DMSO:ta. Biokemiallisen määritysalustan toimivuus varmistettiin signaalin vaihtelun arvioinnilla sekä edelleen todentamalla yhdisteiden seulonnan yhteydessä. Huomattavaa on, että yhdisteet altistuvat inkubaation aikana huonelämpötilan vaihteluille, mikä johtaa merkittäviin vaihteluihin tuloksissa yhdisteiden osalta.

Solupohjaista määritysalustaa ei voitu saattaa päätökseen projektin laajuudesta sekä alkuperäisen laitteiston korvaamisesta johtuvan ajan puutteen vuoksi. Aikarajoituksesta johtuen testisuunnitelmia ei voitu perusteellisesti käydä läpi, joten tuloksia voidaan pitää alustavina. Olennaisinta on varmistaa solujen elinkelpoisuus 96-kuoppalevylle kylvön jälkeen, sillä tämä on suurin vaihtelun aiheuttaja tuloksissa. Toinen näkökohta on doxycyclinin käyttö, mikä saattaa johtaa yhteisvaikutukseen substraatin kanssa.