Polymorfioiden määritysmenetelmän optimointi: 5HTTLPR, rs25531 ja MAOA-uVNTR -polymorfiat oikeuslääketieteellisessä tutkimusaineistossa

Abstract

Aivoissa tapahtuva tiedonvälitys perustuu hermosolujen väliseen sähköiseen ja kemialliseen viestintään. Kemiallisesta viestinnästä vastaavat välittäjäaineet, joiden tehtävänä on siirtää hermosolussa sähköisesti kulkeva viesti kemiallisessa muodossa synapsiraon yli seuraavaan hermosoluun. Serotoniini on yksi aivojen tärkeimmistä hermoimpulssia voimistavista välittäjäaineista, jonka määrän on todettu vähentyvän esimerkiksi masennustiloissa. Aivojen serotoniinivajetta pyritään korjaamaan muun muassa estämällä sen takaisinkuljetusta hermosoluun. Tällä mekanismilla toimivia masennuslääkkeitä kutsutaan selektiivisiksi serotoniinin takaisin oton estäjiksi (SSRI), joista masennuslääke sitalopraami on yksi esimerkki. Serotoniinipitoisuutta voidaan pyrkiä korjaamaan myös estämällä serotoniinin hajotusta hermosoluissa.

Tämän insinöörityön tavoitteena oli pystyttää ja optimoida serotoniinin metaboliaan liitetyn MAOA-uVNTR-polymorfian ja sitalopraamin farmakodynamiikkaan liittyvien 5HTTLPR ja rs25531 polymorfioiden määritysmenetelmä. MAOA-uVNTR on serotoniinia presynaptisissa hermopäätteissä hajottavan MAOA-entsyymin säätelyalueella oleva, entsyymin tehokkuuteen vaikuttava vaihtelevalukuinen toistojakso. 5HTTLPR ja rs25531 ovat serotoniinin kuljetusproteiinin SLC6A4:n transkriptiotehokkuuteen vaikuttavia polymorfioita, jotka sijaitsevat kuljetusproteiinia koodaavan geenin säätelyalueella.

Menetelmän pystytyksen ja optimoinnin jälkeen tutkittujen polymorfioiden yleisyys määritettiin oikeuslääketieteellisestä tutkimusaineistosta. Aineisto oli valittu verrokkiaineistoksi sitalopraamin farmakogenetiikan ja itsemurhien välistä yhteyttä tutkivaan väitöskirjatyöhön. Saatujen tulosten oikeellisuus ja menetelmän luotettavuus varmistettiin lopuksi vielä sekvensoinnin avulla.

Menetelmä saatiin toimimaan hyvin ja luotettavasti. Määritetyssä aineistossa yleisin MAOA-uVNTR-alueen alleeli oli sekä miehillä että naisilla neljän toistonjakson eli nopean entsyymitehokkuuden alleelimuoto 4 ja 5HTTLPR-alueen yleisin alleeli sekä miehillä että naisilla oli normaalilla transkriptiotehokkuudella toimiva alleelimuoto 16A.

Neuronal communication is based on electronic and chemical signaling between nerve cells. Chemical messengers, known as neurotransmitters, are responsible for signal transmission across the synaptic cleft when electrical signal proceeds from presynaptic to postsynaptic neuron. Neurotransmitters are divided in two categories, inhibitory and excitatory neurotransmitters. Serotonin is one of the most important excitatory neurotransmitter in the brain and decreased serotonergic activity may lead to depression. In case of depression, serotonin levels may be increased by preventing the transport of serotonin from synaptic cleft back to the presynaptic nerve cell. Drugs, acting with described mechanism, are called selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), of which citalopram is one example. Serotonin levels may also be increased by blocking the catabolism of serotonin.

The aim of this thesis was to set up and optimize a genotyping method for the MAOA-uVNTR, 5HTTLPR and rs25531 polymorphisms. These polymorphisms are related to metabolism of serotonin and pharmacodynamics of citalopram, respectively. MAOA-uVNTR, situated in the regulatory region of a gene MAOA, affects the efficiency of the forming enzyme MAOA. MAOA enzyme is responsible of serotonin metabolism in the presynaptic nerve cell. Instead, 5HTTLPR and rs25531 are polymorphisms in the regulatory region of the SLC6A4 gene, which codes the serotonin transporter, target of citalopram. Both 5HTTLPR and rs25531 affect the transcription efficiency of the forming protein.

After the set up and optimization of the method, the polymorphisms were analyzed from a medico-legal research material. These subjects were selected as controls for a PhD study, which investigates the relationship between the pharmacogenetics of citalopram and suicide. The accuracy of the results and the reliability of the method were ensured by sequencing the found alleles.

The developed method worked well, and it was reliable. The most common allele in the MAOA-uVNTR area, in both men and female was allele 4, which is the rapid enzyme effectiveness allele, and the most common allele in 5HTTLPR area, both in men and female was the normally functioning long allele 16A.