Mykoplasman tunnistaminen soluviljelyistä PCR-menetelmällä
Lehtiniemi, Laura; Virtanen, Roosa (2015)
Lehtiniemi, Laura
Virtanen, Roosa
Oulun ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015110916121
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015110916121
Tiivistelmä
Soluviljely on menetelmä, jonka avulla elävien solujen toimintaa voidaan tutkia kontrolloiduissa laboratorio-olosuhteissa. Soluviljelytekniikkaa sovelletaan koko ajan kasvavissa määrin sekä akateemisissa tutkimustarkoituksissa, että teollisuuden parissa esimerkiksi lääke- ja rokotetuotannossa. Jotta soluviljelyn avulla saataisiin luotettavia tutkimustuloksia, tulee käytettyjen solulinjojen olla ehdottoman puhtaita. Yksi soluviljelytekniikan merkittävimmistä haittapuolista onkin sen alttius kontaminaatioille, erityisesti mykoplasmalle.
Mykoplasma on pieni, soluseinätön bakteeri, joka kontaminoi helposti soluviljelyitä. Pienen kokonsa tähden se läpäisee helposti suodattimet ja soluseinättömyytensä ansiosta siihen eivät tehoa kaikki antibiootit. Jokaisella soluviljelylaboratoriolla tulisi olla hyvä menetelmä solulinjojensa testaamiseen mykoplasmojen varalta. Yleisimpiä soluviljelyitä kontaminoivia mykoplasma-lajeja ovat M. arginini, M. pirum, M. orale, M. hominis, M. fermentans, M. salivarium ja Acholeplasma laidlawii. Polymeraasiketjureaktio eli PCR on nopea ja herkkä menetelmä mykoplasman tunnistamiseksi soluviljelyistä.
Tämä opinnäytetyöprojekti käynnistyi syksyllä 2014 ValiRX Finland Oy:n eli ValiFinn:n tilaamana. Työn tarkoituksena oli testata PCR-menetelmää ValiFinn:n syöpäsolulinjojen mykoplasmakontaminaatioiden havaitsemisessa sekä kokeilla kahden eri valmistajan PCR-kitin toimivuutta työn suorituksessa. Käyttämämme PCR-kitit olivat Promokinen Mycoplasma Detection Kit I/C sekä Sigma-Aldrichin LookOut® Mycoplasma PCR Detection kit. Opinnäytetyön tavoitteena oli tuottaa ValiFinn:lle luotettavaa teoreettista ja käytännöllistä tietoa PCR-menetelmän käytöstä solulinjojen mykoplasmatestauksessa osana soluviljelylaboratorion laaduntarkkailua sekä sen soveltuvuudesta heidän omien solulinjojensa testaamiseen.
PCR-menetelmä osoittautui nopeaksi ja helposti toteutettavaksi menetelmäksi soluviljelyiden mykoplasmakontaminaatioiden havaitsemiseksi. Ongelmia ilmeni kuitenkin solujen kasvatusmediumista valmistettujen näytteiden inhiboitumisen kanssa. Inhiboivia tekijöitä pyrittiin eliminoimaan erilaisia näytteentekomenetelmiä kokeilemalla. PCR-reaktio onnistui parhaiten näytteentekomenetelmillä, jossa mykoplasmaa konsentroitiin ja jossa solujen eristetystä DNA:sta tehtiin 1:100 laimennos. Kaupallisista PCR-kiteistä Sigma-Aldrichin LookOut® PCR Mycoplasma Detection Kit osoittautui paremmaksi, sillä sen kontrollit toimivat jokaisessa testauksessa, kun taas Promokinen Mycoplasma Detection Kit I/C:ssä kontrollit toimivat vain harvoin. Toimivalla PCR-kitillä ja oikealla näytteentekomenetelmällä PCR on todella kätevä menetelmä ValiFinn:n solujen testaamiseen.
Mykoplasma on pieni, soluseinätön bakteeri, joka kontaminoi helposti soluviljelyitä. Pienen kokonsa tähden se läpäisee helposti suodattimet ja soluseinättömyytensä ansiosta siihen eivät tehoa kaikki antibiootit. Jokaisella soluviljelylaboratoriolla tulisi olla hyvä menetelmä solulinjojensa testaamiseen mykoplasmojen varalta. Yleisimpiä soluviljelyitä kontaminoivia mykoplasma-lajeja ovat M. arginini, M. pirum, M. orale, M. hominis, M. fermentans, M. salivarium ja Acholeplasma laidlawii. Polymeraasiketjureaktio eli PCR on nopea ja herkkä menetelmä mykoplasman tunnistamiseksi soluviljelyistä.
Tämä opinnäytetyöprojekti käynnistyi syksyllä 2014 ValiRX Finland Oy:n eli ValiFinn:n tilaamana. Työn tarkoituksena oli testata PCR-menetelmää ValiFinn:n syöpäsolulinjojen mykoplasmakontaminaatioiden havaitsemisessa sekä kokeilla kahden eri valmistajan PCR-kitin toimivuutta työn suorituksessa. Käyttämämme PCR-kitit olivat Promokinen Mycoplasma Detection Kit I/C sekä Sigma-Aldrichin LookOut® Mycoplasma PCR Detection kit. Opinnäytetyön tavoitteena oli tuottaa ValiFinn:lle luotettavaa teoreettista ja käytännöllistä tietoa PCR-menetelmän käytöstä solulinjojen mykoplasmatestauksessa osana soluviljelylaboratorion laaduntarkkailua sekä sen soveltuvuudesta heidän omien solulinjojensa testaamiseen.
PCR-menetelmä osoittautui nopeaksi ja helposti toteutettavaksi menetelmäksi soluviljelyiden mykoplasmakontaminaatioiden havaitsemiseksi. Ongelmia ilmeni kuitenkin solujen kasvatusmediumista valmistettujen näytteiden inhiboitumisen kanssa. Inhiboivia tekijöitä pyrittiin eliminoimaan erilaisia näytteentekomenetelmiä kokeilemalla. PCR-reaktio onnistui parhaiten näytteentekomenetelmillä, jossa mykoplasmaa konsentroitiin ja jossa solujen eristetystä DNA:sta tehtiin 1:100 laimennos. Kaupallisista PCR-kiteistä Sigma-Aldrichin LookOut® PCR Mycoplasma Detection Kit osoittautui paremmaksi, sillä sen kontrollit toimivat jokaisessa testauksessa, kun taas Promokinen Mycoplasma Detection Kit I/C:ssä kontrollit toimivat vain harvoin. Toimivalla PCR-kitillä ja oikealla näytteentekomenetelmällä PCR on todella kätevä menetelmä ValiFinn:n solujen testaamiseen.