DNA-eristysmenetelmän kehitys papaijalle ja pellavansiemenelle, ja papaijan PCRmenetelmän validoinnin aloitus
Hölttä, Matti (2015)
Hölttä, Matti
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120319251
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120319251
Tiivistelmä
Tässä opinnäytetyössä tutkittiin eri DNA-eristysmenetelmien toimivuutta papaijalle (Carica papaya) ja pellavansiemenelle (Linum usitatissimum). Menetelminä olivat Tullilaboratoriolla normaalissa käytössä olevat Biotecon Foodproof Preparation Kit III ja kaksi eri CTABmenetelmää, joita muokattiin edelleen tarpeen mukaan. Näytteitä esikäsiteltiin monella tavalla, jotta selvisi, mikä tapa olisi tietylle matriisille paras. Kaikki eristetty DNA analysoitiin reaaliaikaisella PCR-laitteella (qPCR), jossa näytteen CT-arvoa verrattiin tarkkailunäytteisiin. Tämän lisäksi työssä aloitettiin papaijan PCR-menetelmän validointiprosessia selvittämällä sen spesifisyyttä ja herkkyyttä. Työ tehtiin Tullilaboratorion Elintarviketutkimukset II -jaostolle.
Kaupallisella Biotecon-kitillä ei voitu eristää papaijasta DNA:ta, joka ei sisältänyt ilmeisiä polymeraasireaktioita inhiboivia aineita. Edes hyvän puhtausarvon antaneet näytteet eivät monistuneet hyvin. Käyttäen muokattua versiota Adam Healeyn suunnittelemasta CTABmenetelmästä siemenettömästä ruokapapaijasta ja raakapapaijasta saatiin eristettyä kohtalaisella saannolla hyvin puhdasta DNA:ta, joka monistui hyvin qPCR:ssä. Pellavansiemenistä ei onnistuttu millään menetelmällä eristämään monistuskelpoista DNA:ta. Saannot siitä olivat joka menetelmällä korkeita, mutta puhtausarvot olivat erittäin huonoja ja monistus huonoa. CTAB-menetelmät eivät eristäneet hyväksyttävän laatuista DNA:ta soijapaputarkkailunäytteistä, joten menetelmät vaativat vielä säätöä.
Papaijan PCR-menetelmä todettiin spesifiseksi 18 muun kasvin ja kahden eläimen DNA:ta vastaan. Herkkyyttä kokeiltiin viidellä eri kymmenkertaisella kopiomäärätasolla kuudella toistolla. 10 000-, 1 000- ja 100- kopioiset kaivot monistuivat noin 3,33 syklin välillä toisistaan oletetusti. 10-kopioiset kaivot monistuivat 2,7 sykliä 100 kopioisten jälkeen. 1 kopioiset kaivot eivät monistuneet ollenkaan. Papaijan PCR-menetelmän toteamisrajaksi todettiin 10 kopiota.
Kaupallisella Biotecon-kitillä ei voitu eristää papaijasta DNA:ta, joka ei sisältänyt ilmeisiä polymeraasireaktioita inhiboivia aineita. Edes hyvän puhtausarvon antaneet näytteet eivät monistuneet hyvin. Käyttäen muokattua versiota Adam Healeyn suunnittelemasta CTABmenetelmästä siemenettömästä ruokapapaijasta ja raakapapaijasta saatiin eristettyä kohtalaisella saannolla hyvin puhdasta DNA:ta, joka monistui hyvin qPCR:ssä. Pellavansiemenistä ei onnistuttu millään menetelmällä eristämään monistuskelpoista DNA:ta. Saannot siitä olivat joka menetelmällä korkeita, mutta puhtausarvot olivat erittäin huonoja ja monistus huonoa. CTAB-menetelmät eivät eristäneet hyväksyttävän laatuista DNA:ta soijapaputarkkailunäytteistä, joten menetelmät vaativat vielä säätöä.
Papaijan PCR-menetelmä todettiin spesifiseksi 18 muun kasvin ja kahden eläimen DNA:ta vastaan. Herkkyyttä kokeiltiin viidellä eri kymmenkertaisella kopiomäärätasolla kuudella toistolla. 10 000-, 1 000- ja 100- kopioiset kaivot monistuivat noin 3,33 syklin välillä toisistaan oletetusti. 10-kopioiset kaivot monistuivat 2,7 sykliä 100 kopioisten jälkeen. 1 kopioiset kaivot eivät monistuneet ollenkaan. Papaijan PCR-menetelmän toteamisrajaksi todettiin 10 kopiota.