DNA:n eristys FFPE-kudoksesta : Eristysmenetelmän kehittäminen TMA-laitteella otetuille munuaissyöpäkudospaloille
Ruuskanen, Mari; Pääkkönen, Niina; Ruotsalainen, Annamari (2018)
Ruuskanen, Mari
Pääkkönen, Niina
Ruotsalainen, Annamari
Savonia-ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201805147924
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201805147924
Tiivistelmä
Biopankkien hallinnassa olevat kudosnäytekokoelmat toimivat merkittävänä resurssina lääketieteellisissä tutkimuk-sissa. Näytteiden säilyttäminen formaliiniin fiksoituna ja parafiinilla peitettyinä FFPE-kudosnäytteinä (formalin-fixed, paraffin embedded) mahdollistaa näytteiden tutkimisen takautuvasti, koska kudosrakenne saadaan säilytettyä en-nallaan. Näytteiden ja tietoaineistojen avulla voidaan kehittää uudenlaisia lääkkeitä, diagnostisia menetelmiä ja esimerkiksi potilaalle yksilöllisesti sopivia hoitoja, sekä varmistaa niiden toimivuus.
Opinnäytetyö oli Itä-Suomen Biopankille tehtävä kehittämistyö, jonka tavoitteena oli kehittää TMA-laitteella otetuil-le munuaissyöpäkudospaloille toimiva DNA:n eristysmenetelmä. Tarkoituksena oli eristää DNA:ta FFPE-munuaissyöpäkudoksesta ja varmistaa eristetyn DNA:n laatu eli pitoisuus, puhtaus ja eheys. DNA:n eristämisestä laadittiin myös työohje, joka jäi Itä-Suomen Biopankin käyttöön tulevia munuaissyöpäkudoksesta tehtäviä DNA:n eristyksiä varten.
DNA:n eristyksissä käytetyt näytteet olivat Itä-Suomen Biopankin hallinnassa olevia 13–18 vuotta vanhoja parafii-niin valettuja, formaliinifiksoituja munuaissyöpäkudosnäytteitä. Työssä käytettiin QIAGENin GeneRead FFPE -kittiä, joka on tarkoitettu genomisen DNA:n eristämiseksi FFPE-kudoksesta. Näytteet eluoitiin spin-kolonnista kolme ker-taa, jotta varmistuttiin kaiken DNA:n irronneen kolonnin kalvolta. Eristetyn DNA:n pitoisuus ja puhtaus mitattiin mikrovolyymispektrofotometrillä ja eheys geelielektroforeesiin perustuvalla analysaattorilla. DNA:n eristämiseen tarkoitettu työohje laadittiin munuaisyöpäkudosta varten kitin ohjetta mukaillen.
Eristettyjen DNA-näytteiden pitoisuudet olivat suurimpia ensimmäisessä eluutiossa, puhtauksien ollessa myös hy-väksytyissä raja-arvoissa. Toisessa ja kolmannessa eluutiossa DNA:n pitoisuudet ja puhtaudet laskivat huomatta-vasti verrattuna ensimmäiseen eluutioon. DNA:n eheys mitattiin ainoastaan ensimmäisen eluution näytteistä. Kol-masosassa näytteistä DNA oli riittävän eheää jatkokäyttöä ajatellen.
Johtopäätöksinä voitiin todeta, että FFPE-munuaissyöpäkudoksesta eristetty DNA oli yleisesti ottaen melko pilkkou-tunutta. Tuloksista havaittiin, että mitä vanhempi näyte oli, sitä pilkkoutuneempaa siitä eristetty DNA oli. Näytteen pitoisuuteen ja saantoon näytteen iällä ei ollut vaikutusta. Näytteen ottokohdalla, tuumorin keskeltä tai reunasta, ei ollut vaikutusta DNA:n eheyteen eikä sen pitoisuuteen tai puhtauteen.
Opinnäytetyö oli Itä-Suomen Biopankille tehtävä kehittämistyö, jonka tavoitteena oli kehittää TMA-laitteella otetuil-le munuaissyöpäkudospaloille toimiva DNA:n eristysmenetelmä. Tarkoituksena oli eristää DNA:ta FFPE-munuaissyöpäkudoksesta ja varmistaa eristetyn DNA:n laatu eli pitoisuus, puhtaus ja eheys. DNA:n eristämisestä laadittiin myös työohje, joka jäi Itä-Suomen Biopankin käyttöön tulevia munuaissyöpäkudoksesta tehtäviä DNA:n eristyksiä varten.
DNA:n eristyksissä käytetyt näytteet olivat Itä-Suomen Biopankin hallinnassa olevia 13–18 vuotta vanhoja parafii-niin valettuja, formaliinifiksoituja munuaissyöpäkudosnäytteitä. Työssä käytettiin QIAGENin GeneRead FFPE -kittiä, joka on tarkoitettu genomisen DNA:n eristämiseksi FFPE-kudoksesta. Näytteet eluoitiin spin-kolonnista kolme ker-taa, jotta varmistuttiin kaiken DNA:n irronneen kolonnin kalvolta. Eristetyn DNA:n pitoisuus ja puhtaus mitattiin mikrovolyymispektrofotometrillä ja eheys geelielektroforeesiin perustuvalla analysaattorilla. DNA:n eristämiseen tarkoitettu työohje laadittiin munuaisyöpäkudosta varten kitin ohjetta mukaillen.
Eristettyjen DNA-näytteiden pitoisuudet olivat suurimpia ensimmäisessä eluutiossa, puhtauksien ollessa myös hy-väksytyissä raja-arvoissa. Toisessa ja kolmannessa eluutiossa DNA:n pitoisuudet ja puhtaudet laskivat huomatta-vasti verrattuna ensimmäiseen eluutioon. DNA:n eheys mitattiin ainoastaan ensimmäisen eluution näytteistä. Kol-masosassa näytteistä DNA oli riittävän eheää jatkokäyttöä ajatellen.
Johtopäätöksinä voitiin todeta, että FFPE-munuaissyöpäkudoksesta eristetty DNA oli yleisesti ottaen melko pilkkou-tunutta. Tuloksista havaittiin, että mitä vanhempi näyte oli, sitä pilkkoutuneempaa siitä eristetty DNA oli. Näytteen pitoisuuteen ja saantoon näytteen iällä ei ollut vaikutusta. Näytteen ottokohdalla, tuumorin keskeltä tai reunasta, ei ollut vaikutusta DNA:n eheyteen eikä sen pitoisuuteen tai puhtauteen.