DNA:n eristys FFPE-kudoksesta : Eristysmenetelmän kehittäminen TMA-laitteella otetuille munuaissyöpäkudospaloille

Abstract

Biopankkien hallinnassa olevat kudosnäytekokoelmat toimivat merkittävänä resurssina lääketieteellisissä tutkimuk-sissa. Näytteiden säilyttäminen formaliiniin fiksoituna ja parafiinilla peitettyinä FFPE-kudosnäytteinä (formalin-fixed, paraffin embedded) mahdollistaa näytteiden tutkimisen takautuvasti, koska kudosrakenne saadaan säilytettyä en-nallaan. Näytteiden ja tietoaineistojen avulla voidaan kehittää uudenlaisia lääkkeitä, diagnostisia menetelmiä ja esimerkiksi potilaalle yksilöllisesti sopivia hoitoja, sekä varmistaa niiden toimivuus.

Opinnäytetyö oli Itä-Suomen Biopankille tehtävä kehittämistyö, jonka tavoitteena oli kehittää TMA-laitteella otetuil-le munuaissyöpäkudospaloille toimiva DNA:n eristysmenetelmä. Tarkoituksena oli eristää DNA:ta FFPE-munuaissyöpäkudoksesta ja varmistaa eristetyn DNA:n laatu eli pitoisuus, puhtaus ja eheys. DNA:n eristämisestä laadittiin myös työohje, joka jäi Itä-Suomen Biopankin käyttöön tulevia munuaissyöpäkudoksesta tehtäviä DNA:n eristyksiä varten.

DNA:n eristyksissä käytetyt näytteet olivat Itä-Suomen Biopankin hallinnassa olevia 13–18 vuotta vanhoja parafii-niin valettuja, formaliinifiksoituja munuaissyöpäkudosnäytteitä. Työssä käytettiin QIAGENin GeneRead FFPE -kittiä, joka on tarkoitettu genomisen DNA:n eristämiseksi FFPE-kudoksesta. Näytteet eluoitiin spin-kolonnista kolme ker-taa, jotta varmistuttiin kaiken DNA:n irronneen kolonnin kalvolta. Eristetyn DNA:n pitoisuus ja puhtaus mitattiin mikrovolyymispektrofotometrillä ja eheys geelielektroforeesiin perustuvalla analysaattorilla. DNA:n eristämiseen tarkoitettu työohje laadittiin munuaisyöpäkudosta varten kitin ohjetta mukaillen.

Eristettyjen DNA-näytteiden pitoisuudet olivat suurimpia ensimmäisessä eluutiossa, puhtauksien ollessa myös hy-väksytyissä raja-arvoissa. Toisessa ja kolmannessa eluutiossa DNA:n pitoisuudet ja puhtaudet laskivat huomatta-vasti verrattuna ensimmäiseen eluutioon. DNA:n eheys mitattiin ainoastaan ensimmäisen eluution näytteistä. Kol-masosassa näytteistä DNA oli riittävän eheää jatkokäyttöä ajatellen.

Johtopäätöksinä voitiin todeta, että FFPE-munuaissyöpäkudoksesta eristetty DNA oli yleisesti ottaen melko pilkkou-tunutta. Tuloksista havaittiin, että mitä vanhempi näyte oli, sitä pilkkoutuneempaa siitä eristetty DNA oli. Näytteen pitoisuuteen ja saantoon näytteen iällä ei ollut vaikutusta. Näytteen ottokohdalla, tuumorin keskeltä tai reunasta, ei ollut vaikutusta DNA:n eheyteen eikä sen pitoisuuteen tai puhtauteen.

Biobanks have collections of tissue samples that are a major resource in medical research. Preservation of tissues in FFPE blocks (formalin-fixed, paraffin embedded) allows the tissues to be retrospectively studied because the tissue structure remains unchanged. Samples and sample data can be used to develop novel drugs, diagnostic methods and customized treatments for patients and to ensure their functionality.

This thesis was a development work for the Biobank of Eastern Finland that had an aim to develop a DNA isolation method for the tissue samples taken out of kidney cancer specimens with a TMA-device. The purpose of the thesis was to extract DNA from FFPE-kidney cancer tissue and to ensure the quality of the extracted DNA; i.e. its concen-tration, purity and integrity. The protocol for the DNA isolation was also developed to be used in the Biobank of Eastern Finland in future DNA isolations from kidney cancer samples.

The samples used in DNA isolation were 13-18 years old FFPE kidney cancer samples from the Biobank of Eastern Finland. The QIAGEN GeneRead FFPE kit that is designed for purification of genomic DNA from FFPE tissues, was used for the isolation of DNA. The DNA was eluted three times from the isolation column to make sure that all of the DNA had been removed from the silica membrane of the column. The concentration and purity of the extracted DNA was determined by a spectrophotometer and the integrity by a gel electrophoresis-based analyzer. The isola-tion protocol for genomic DNA was prepared for the kidney tissue, in line with the kit’s instructions.

The concentration of the extracted DNA was highest in the first elution, with purities also at acceptable limits. In the second and third elution the DNA concentration and purity decreased considerably compared to the first elu-tion. The integrity of the extracted DNA was determined only from the first elution. One third of the samples had enough intact DNA for further use.

In conclusion, it was found that genomic DNA extracted from FFPE kidney cancer tissues was generally quite fragmented. It was observed that the age of the sample had effect on the fragmentation of the isolated DNA; DNA from older tissue was more fragmented than DNA from younger tissue. The age of the sample had no effect on the concentration and the yield of the isolated DNA. It was also observed that the site of the sample (taken from the center or the edge of tumor) had no effect on concentration, purity or integrity of DNA.