Optimization of High-Throughput Screening Method for Proteins

Abstract

This thesis was done at Oulu University at the Department of Biochemistry in the research group of Inari Kursula in the autumn and spring of 2013. The objective of this study was to optimize the high-throughput screening protocol conditions for soluble proteins, membrane proteins and complexes. The original protocol was already at the research group's disposal but not much used. The protocol consists of four parts: lysis, high-throughput screening, dot blotting and western blotting of proteins. Protein blotting is the transfer of proteins from samples to membranes. It is a popular technique for visualization and identification of proteins. Lysis and high-throughput screening were made in 96-well format, and so screening buffers were also made in 96-well format in such a way that every well had a different buffer composition. Firstly a protein expression was made in competent E.coli rosetta DE3 cells with formin F1.FH2 with PCR amplification. The protocol was optimized first for soluble proteins and then tested for membrane proteins and complexes. Mostly formin and actin proteins were the target proteins used in the experiments since the research group studies the motility and host cell invasion of the parasite, Plasmodium spp., causing malaria and actin is the central protein of the parasite's motility and invasion of host cells. The protocol was successfully optimized for soluble proteins and then also successfully tested on membrane proteins and complexes. On the basis of the results gotten from the optimization, the protocol is ready to be actively used in laboratory work and should provide nice results for example when searching for protein purification conditions. This work should also provide a very nice starting point for even further optimization.

Opinnäytetyö tehtiin Oulun yliopiston biokemian laitoksella Inari Kursulan tutkimusryhmässä syksyllä ja keväällä 2013. Työn tavoitteena oli optimoida tehoseulontamenetelmän protokolla liukoisille proteiineille, kalvoproteiineille ja komplekseille. Alkuperöinen protokolla oli jo saatavilla tutkimusryhmällä, mutta se oli erittäin vähän käytetty, mikä johtui epätietoisuudesta menetelmästä. Protokolla koostuu neljästä osasta: solujen hajoittaminen, tehoseulonta sekä dot blot ja western blot menetelmät. Ne ovat suosittuja tekniikoita proteiinien visualisointia ja tunnistamista varten.

Solujen hajoitus ja tehoseulonta tehtiin 96-kuoppalevyillä ja siksi seulonta puskureita tehtiin myös 96-kuoppalevyille siten, että jokainen kuoppa sisälsi erilaiset puskuri koostumukset. Aluksi proteiini ekspressio tehtiin kompetenteissa E.coli Rosetta DE3 soluissa formin F1.FH2 proteiinilla ja PCR menetelmällä vahvistamalla. Protokolla optimoitiin ensin liukoisille proteiineille ja sitten testattiin kalvoproteiineilla ja komplekseilla. Enimmäkseen formin ja aktiini proteiinit olivat käytetyt kohdeproteiinit kokeissa, sillä tutkimusryhmä tutkii parasiitin, plasmodium spp., liikkuvuutta ja soluinvaasiota. Parasiitti aiheuttaa malariaa ja aktiini on keskeinen proteiini loisen liikkuvuudessa ja soluinvaasiossa.

Protokolla optimoitiin onnistuneesti liukoisille proteiineille ja myös onnistuneesti testattiin kalvoproteiineille ja komplekseille. Tulosten perusteella protokolla on valmis käytettäväksi laboratoriotyöskentelyssä ja protokollan pitäisi tuottaa hyviä tuloksia esimerkiksi tutkittaessa proteiinipuhdistukseen sopivia olosuhteita. Työ on myös hyvä pohja jatkossa tehtävällä optimoinnille.