SLIC-kloonausmenetelmän optimointi

Abstract

Työn tavoitteena oli englanninkielisen protokollan koostaminen ja optimointi sekvenssi- ja ligaatioriippumattomalle kloonausmenetelmälle. Protokolla tulisi Oulun ja Hampurin yliopistoilla toimivan, Inari Kursulan johtaman molekyylibiologian tutkimusryhmän käyttöön. Menetelmä oli otettu suhteellisen vasta käyttöön ja kirjallista ohjeistusta ei ollut vielä kerätty yhteen. Samalla pyrittiin lyhentämään päivittäistä työaikaa, sillä kloonausmenetelmää käytettäessä sitä kului yli kahdeksan tuntia ennen protokollan optimointia.

SLIC-menetelmällä voidaan valmistaa vektorin ja useamman insertin sisältävä konstrukti yhden kloonauskerran aikana ilman erillisiä subkloonausvaiheita. Optimoinnissa keskityttiin eri työvaiheiden lyhentämiseen ilman, että työvaiheen tuloksen laatu heikkenisi. Samalla testattiin myös kahta vaihtoehtoista agaroosigeelielektroforeesipuskuria normaalin TRIS-asetaatti-EDTA -puskurin mahdolliseksi korvaajaksi.

Protokollan optimoinnilla saavutettiin parhaimmillaan noin kahden tunnin työaikasäästö, joka oli varsin tyydyttävä tulos. Sen lisäksi laboratoriossa on nyt jokaisella työntekijällä mahdollisuus perehtyä kloonausmenetelmän käyttöön huomattavasti helpommin, kun kaikki sen käyttöön liittyvä perustieto on kerätty yhteen. Englanninkielinen protokolla löytyy liitteenä tämän opinnäytetyön lopusta.

This thesis was made based on the work done in research group of Inari Kursula at the Oulu University in the Department of Biochemistry. The aim of this work was to gather all relevant information about recently introduced sequence- and ligation-independent cloning protocol in one place for easy access. Each step of the protocol was also optimized in order to achieve a shorter completion time for the entire process of creating a viable expression construct. The protocol was to be used on molecular cloning projects pertaining to malaria research and other protein structural studies conducted in the group.

Sequence- and ligation-independent cloning method allows for a rapid completion of a plasmid construct. Construct, which contains a target vector and single or multiple inserts, can to be constructed in a single cloning step instead of multiple subcloning steps required by regular restriction cloning protocols.

The optimization of this protocol led to time savings between one and two hours, which was a satisfactory result. In addition to this, each new worker can now get all the information they need to transition to a new type of cloning more easily and acquire productive proficiency in this type of cloning method in a shorter time than was possible before the information was collected and optimized. The protocol file written in English is included in this thesis as an attachment.